ყოვლისმომცველი პროტეომიკა ავლენს ტვინზე დაფუძნებულ ცერებროსპინალურ სითხის ბიომარკერებს ასიმპტომური და სიმპტომური ალცჰეიმერის დაავადების დროს

ალცჰეიმერის დაავადებას (AD) აკლია ცილის ბიომარკერები, რომლებიც ასახავს მის მრავალ პათოფიზიოლოგიას, რაც აფერხებს დიაგნოსტიკისა და მკურნალობის პროგრესს. აქ ჩვენ ვიყენებთ ყოვლისმომცველ პროტეომიკას ცერებროსპინალური სითხის (CSF) ბიომარკერების დასადგენად, რომლებიც წარმოადგენენ AD პათოფიზიოლოგიის ფართო სპექტრს. მულტიპლექსური მასის სპექტრომეტრიამ გამოავლინა დაახლოებით 3,500 და დაახლოებით 12,000 ცილა AD CSF-ში და ტვინში, შესაბამისად. ტვინის პროტეომის ქსელურმა ანალიზმა გადაჭრა ბიომრავალფეროვნების 44 მოდული, რომელთაგან 15 გადახურულია ცერებროსპინალური სითხის პროტეომასთან. CSF AD მარკერები ამ გადახურულ მოდულებში იკეცება ხუთ ცილოვან ჯგუფად, რომლებიც წარმოადგენენ სხვადასხვა პათოფიზიოლოგიურ პროცესებს. სინაფსები და მეტაბოლიტები AD ტვინში მცირდება, მაგრამ CSF იზრდება, ხოლო გლიით მდიდარი მიელინაცია და იმუნური ჯგუფები თავის ტვინში და CSF-ში იზრდება. პანელის ცვლილებების თანმიმდევრულობა და დაავადების სპეციფიკა დადასტურდა 500-ზე მეტ დამატებით CSF ნიმუშში. ამ ჯგუფებმა ასევე გამოავლინეს ბიოლოგიური ქვეჯგუფები უსიმპტომო AD-ში. მთლიანობაში, ეს შედეგები პერსპექტიული ნაბიჯია ვებ-ბიომარკერების ინსტრუმენტებისკენ, კლინიკური აპლიკაციებისთვის AD-ში.
ალცჰეიმერის დაავადება (AD) არის ნეიროდეგენერაციული დემენციის ყველაზე გავრცელებული მიზეზი მსოფლიოში და ხასიათდება ბიოლოგიური სისტემის დისფუნქციების ფართო სპექტრით, მათ შორის სინაფსური გადაცემა, გლიური შუამავლობითი იმუნიტეტი და მიტოქონდრიული მეტაბოლიზმი (1-3). თუმცა, მისი დადგენილი ცილის ბიომარკერები კვლავ ფოკუსირებულია ამილოიდის და ტაუ პროტეინის გამოვლენაზე და, შესაბამისად, ვერ ასახავს ამ მრავალფეროვან პათოფიზიოლოგიას. ეს „ძირითადი“ ცილის ბიომარკერები, რომლებიც ყველაზე საიმედოდ იზომება ცერებროსპინალურ სითხეში (CSF) მოიცავს (i) ამილოიდ ბეტა პეპტიდს 1-42 (Aβ1-42), რომელიც ასახავს კორტიკალური ამილოიდური დაფების წარმოქმნას; (ii) ტოტალური ტაუ, აქსონის გადაგვარების ნიშანი; (iii) ფოსფო-ტაუ (პ-ტაუ), პათოლოგიური ტაუს ჰიპერფოსფორილირების წარმომადგენელი (4-7). მიუხედავად იმისა, რომ ცერებროსპინალური სითხის ამ ბიომარკერებმა დიდად შეუწყო ხელი ჩვენს გამოვლენას AD პროტეინის დაავადებების (4-7), ისინი წარმოადგენენ დაავადების კომპლექსური ბიოლოგიის მხოლოდ მცირე ნაწილს.
AD ბიომარკერების პათოფიზიოლოგიური მრავალფეროვნების ნაკლებობამ გამოიწვია მრავალი გამოწვევა, მათ შორის (i) AD პაციენტების ბიოლოგიური ჰეტეროგენურობის იდენტიფიცირებისა და რაოდენობრივი განსაზღვრის შეუძლებლობა, (ii) დაავადების სიმძიმისა და პროგრესირების არასაკმარისი გაზომვა, განსაკუთრებით პრეკლინიკურ სტადიაში, და ( iii) თერაპიული მედიკამენტების შემუშავება, რომლებმაც ვერ გადაჭრეს ნევროლოგიური გაუარესების ყველა ასპექტი. ჩვენი დამოკიდებულება საეტაპო პათოლოგიაზე, რათა აღვწეროთ AD დაკავშირებული დაავადებებისგან მხოლოდ ამწვავებს ამ პრობლემებს. უფრო და უფრო მეტი მტკიცებულება აჩვენებს, რომ დემენციის მქონე ხანდაზმულთა უმეტესობას აქვს კოგნიტური დაქვეითების ერთზე მეტი პათოლოგიური მახასიათებელი (8). AD პათოლოგიის მქონე პირთა 90%-ს ან მეტს ასევე აქვს სისხლძარღვთა დაავადება, TDP-43 ჩანართები ან სხვა დეგენერაციული დაავადებები (9). პათოლოგიური გადახურვის ამ მაღალმა პროპორციებმა დაარღვია დემენციის ჩვენი ამჟამინდელი დიაგნოსტიკური ჩარჩო და საჭიროა დაავადების უფრო სრულყოფილი პათოფიზიოლოგიური განმარტება.
AD-ს სხვადასხვა ბიომარკერების გადაუდებელი აუცილებლობის გათვალისწინებით, სფერო სულ უფრო მეტად იყენებს "omics" მეთოდს, რომელიც ეფუძნება ბიომარკერების აღმოჩენის მთლიან სისტემას. დაჩქარებული ფარმაცევტული პარტნიორობა (AMP)-AD ალიანსი 2014 წელს დაიწყო და პროგრამის წინა პლანზეა. ჯანდაცვის ეროვნული ინსტიტუტის, აკადემიისა და ინდუსტრიის ეს მულტიდისციპლინური ძალისხმევა მიზნად ისახავს გამოიყენოს სისტემაზე დაფუძნებული სტრატეგიები AD-ის პათოფიზიოლოგიის უკეთ განსაზღვრისათვის და ბიომრავალფეროვნების დიაგნოსტიკური ანალიზისა და მკურნალობის სტრატეგიების შემუშავებისთვის (10). როგორც ამ პროექტის ნაწილი, ქსელის პროტეომიკა გახდა პერსპექტიული ინსტრუმენტი AD-ში სისტემაზე დაფუძნებული ბიომარკერების განვითარებისთვის. მონაცემებზე ორიენტირებული ეს მიუკერძოებელი მიდგომა აწყობს პროტეომიკის მონაცემთა კომპლექსურ კომპლექტს თანაგამოხატული ცილების ჯგუფებად ან „მოდულებად“, რომლებიც დაკავშირებულია უჯრედების სპეციფიკურ ტიპებთან, ორგანელებთან და ბიოლოგიურ ფუნქციებთან (11-13). თითქმის 12 ინფორმაციებით მდიდარი ქსელის პროტეომიკის კვლევა ჩატარდა AD ტვინზე (13-23). მთლიანობაში, ეს ანალიზები მიუთითებს, რომ AD ტვინის ქსელის პროტეომა ინარჩუნებს უაღრესად კონსერვაციას მოდულურ ორგანიზაციას დამოუკიდებელ კოჰორტებში და მრავალ კორტიკალურ რეგიონში. გარდა ამისა, ზოგიერთი ამ მოდული აჩვენებს რეპროდუცირებად ცვლილებებს AD-თან დაკავშირებულ სიმრავლეში მონაცემთა ნაკრებებში, რაც ასახავს მრავალი დაავადების პათოფიზიოლოგიას. ერთობლივად, ეს დასკვნები აჩვენებს პერსპექტიულ წამყვან წერტილს ტვინის ქსელის პროტეომის, როგორც სისტემაზე დაფუძნებული ბიომარკერის აღმოჩენისთვის AD-ში.
AD ტვინის ქსელის პროტეომის კლინიკურად სასარგებლო სისტემურ ბიომარკერებად გარდაქმნის მიზნით, ჩვენ გავაერთიანეთ ტვინისგან მიღებული ქსელი AD CSF-ის პროტეომიურ ანალიზთან. ამ ინტეგრირებულმა მიდგომამ გამოიწვია CSF-ის ბიომარკერების ხუთი პერსპექტიული ნაკრების იდენტიფიცირება, რომლებიც დაკავშირებულია ტვინზე დაფუძნებული პათოფიზიოლოგიის ფართო სპექტრთან, მათ შორის სინაფსებთან, სისხლძარღვებთან, მიელინიზაციასთან, ანთებასთან და მეტაბოლური გზების დისფუნქციასთან. ჩვენ წარმატებით დავადასტურეთ ეს ბიომარკერების პანელები მრავალჯერადი რეპლიკაციის ანალიზის მეშვეობით, მათ შორის 500-ზე მეტი CSF ნიმუში სხვადასხვა ნეიროდეგენერაციული დაავადებებისგან. ეს ვალიდაციის ანალიზები მოიცავს ჯგუფური მიზნების გამოკვლევას CSF-ში პაციენტების ასიმპტომური AD (AsymAD) ან ამილოიდის არანორმალური დაგროვების მტკიცებულებების ჩვენებას ნორმალურ კოგნიტურ გარემოში. ეს ანალიზები ხაზს უსვამს მნიშვნელოვან ბიოლოგიურ ჰეტეროგენობას AsymAD პოპულაციაში და იდენტიფიცირებს პანელის მარკერებს, რომლებსაც შეუძლიათ დაავადების ადრეულ სტადიებზე ინდივიდების ქვეტიპის დადგენა. მთლიანობაში, ეს შედეგები წარმოადგენს საკვანძო ნაბიჯს ცილის ბიომარკერების ინსტრუმენტების შემუშავებაში, რომელიც დაფუძნებულია მრავალ სისტემაზე, რომელსაც შეუძლია წარმატებით გადაჭრას მრავალი კლინიკური გამოწვევა, რომელსაც აწყდება AD.
ამ კვლევის მთავარი მიზანია ცერებროსპინალური სითხის ახალი ბიომარკერების იდენტიფიცირება, რომლებიც ასახავს თავის ტვინის სხვადასხვა პათოფიზიოლოგიას, რაც იწვევს AD-ს. სურათი S1 ასახავს ჩვენი კვლევის მეთოდოლოგიას, რომელიც მოიცავს (i) ყოვლისმომცველ ანალიზს, რომელიც განპირობებულია AD CSF-ის და ქსელის ტვინის პროტეომის წინასწარი დასკვნებით, ტვინთან დაკავშირებული ცერებროსპინალურ დაავადების მრავალი ბიომარკერის იდენტიფიცირებისთვის და (ii) შემდგომი რეპლიკაცია ეს ბიომარკერები არის რამდენიმე დამოუკიდებელ ცერებროსპინალურში. სითხის კოჰორტები. აღმოჩენაზე ორიენტირებული კვლევა დაიწყო CSF-ის დიფერენციალური გამოხატვის ანალიზით 20 კოგნიტიურად ნორმალურ ადამიანში და 20 AD პაციენტში Emory Goizueta ალცჰეიმერის დაავადების კვლევის ცენტრში (ADRC). AD-ის დიაგნოზი განისაზღვრება, როგორც მნიშვნელოვანი კოგნიტური გაუფასურება დაბალი Aβ1-42 და ცერებროსპინალურ სითხეში მთლიანი ტაუსა და პ-ტაუს ამაღლებული დონის არსებობისას [მონრეალის საშუალო კოგნიტური შეფასება (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA). )]] (ცხრილი S1A). კონტროლს (საშუალო MoCA, 26.7 ± 2.2) ჰქონდა CSF ბიომარკერების ნორმალური დონე.
ადამიანის CSF ხასიათდება ცილების სიმრავლის დინამიური დიაპაზონით, რომელშიც ალბუმინს და სხვა უკიდურესად უხვი ცილებს შეუძლიათ ხელი შეუშალონ ინტერესის ცილების გამოვლენას (24). ცილების აღმოჩენის სიღრმის გასაზრდელად, ჩვენ ამოვიღეთ პირველი 14 უხვი ცილა თითოეული CSF ნიმუშიდან მასის სპექტრომეტრიის (MS) ანალიზამდე (24). სულ 39,805 პეპტიდი იყო იდენტიფიცირებული MS-ის მიერ, რომლებიც დაფიქსირდა 3691 პროტეომზე 40 ნიმუშში. ცილების რაოდენობრივი განსაზღვრა ხორციელდება მრავალჯერადი ტანდემური მასის ეტიკეტით (TMT) მარკირებით (18, 25). დაკარგული მონაცემების გადასაჭრელად, ჩვენ ჩავრთეთ მხოლოდ ის პროტეინები, რომლებიც რაოდენობრივად იქნა შეფასებული ნიმუშების სულ მცირე 50%-ში შემდგომ ანალიზში, რითაც საბოლოოდ გამოვთვალეთ 2875 პროტეომი. მთლიანი ცილის სიმრავლის დონეებში მნიშვნელოვანი განსხვავების გამო, საკონტროლო ნიმუში სტატისტიკურად ჩაითვალა გამონაკლისად (13) და არ იყო ჩართული შემდგომ ანალიზში. დარჩენილი 39 ნიმუშის სიმრავლის მნიშვნელობები დარეგულირდა ასაკის, სქესის და სერიული კოვარიანსის მიხედვით (13-15, 17, 18, 20, 26).
სტატისტიკური t-ტესტი ანალიზის გამოყენებით რეგრესიის მონაცემთა ნაკრების დიფერენციალური გამოხატვის შესაფასებლად, ამ ანალიზმა გამოავლინა ცილები, რომელთა სიმრავლის დონეები მნიშვნელოვნად შეიცვალა (P <0.05) საკონტროლო და AD შემთხვევებს შორის (ცხრილი S2A). როგორც 1A სურათზეა ნაჩვენები, AD-ში სულ 225 ცილის სიმრავლე მნიშვნელოვნად შემცირდა და 303 ცილის სიმრავლე მნიშვნელოვნად გაიზარდა. ეს დიფერენციალურად გამოხატული ცილები მოიცავს რამდენიმე ადრე იდენტიფიცირებულ ცერებროსპინალური სითხის AD მარკერებს, როგორიცაა მიკროტუბულებთან ასოცირებული პროტეინი tau (MAPT; P = 3.52 × 10−8), ნეიროფილამენტი (NEFL; P = 6.56 × 10−3), ზრდასთან დაკავშირებული პროტეინი 43. (GAP43; P = 1,46 × 10−5), ცხიმოვანი მჟავების დამაკავშირებელი ცილა 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), ქიტინაზა 3 მსგავსი 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), ნერვული გრანულინი (NRGN; P = 3,43 × 10−4) და VGF ნერვის ზრდის ფაქტორი (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). თუმცა, ჩვენ ასევე გამოვავლინეთ სხვა ძალიან მნიშვნელოვანი სამიზნეები, როგორიცაა მშპ დისოციაციის ინჰიბიტორი 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) და SPARC-თან დაკავშირებული მოდულური კალციუმის შეკავშირება 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). 225 მნიშვნელოვნად შემცირებული პროტეინის გენის ონტოლოგიის (GO) ანალიზმა გამოავლინა მჭიდრო კავშირი სხეულის სითხის პროცესებთან, როგორიცაა სტეროიდული მეტაბოლიზმი, სისხლის კოაგულაცია და ჰორმონების აქტივობა (სურათი 1B და ცხრილი S2B). ამის საპირისპიროდ, მნიშვნელოვნად გაზრდილი ცილა 303 მჭიდროდაა დაკავშირებული უჯრედის სტრუქტურასთან და ენერგეტიკულ მეტაბოლიზმთან.
(A) ვულკანის დიაგრამა აჩვენებს log2 ნაკეცის ცვლილებას (x-ღერძი) -log10 სტატისტიკურ P მნიშვნელობასთან (y-ღერძი), რომელიც მიიღება t-ტესტით, რომელიც გამოიყენება დიფერენციალური გამოხატვის გამოსავლენად საკონტროლო (CT) და შორის. ყველა ცილისგან CSF პროტეომის AD შემთხვევები. ცილები მნიშვნელოვნად შემცირებული დონით (P <0.05) AD-ში ნაჩვენებია ლურჯად, ხოლო პროტეინები, რომლებსაც აქვთ მნიშვნელოვნად გაზრდილი დონე დაავადების დროს ნაჩვენებია წითლად. შერჩეული ცილა ეტიკეტირებულია. (B) ცილებთან დაკავშირებული ზედა GO ტერმინები მნიშვნელოვნად შემცირებულია (ლურჯი) და გაიზარდა (წითელი) AD-ში. აჩვენებს სამი GO ტერმინს უმაღლესი z-ქულით ბიოლოგიური პროცესების, მოლეკულური ფუნქციების და უჯრედული კომპონენტების სფეროებში. (C) MS-მა გაზომა MAPT დონე CSF ნიმუშში (მარცხნივ) და მისი კორელაცია ნიმუშის ELISA ტაუს დონესთან (მარჯვნივ). ნაჩვენებია პირსონის კორელაციის კოეფიციენტი შესაბამისი P მნიშვნელობით. ერთი AD შემთხვევისთვის ELISA მონაცემების არარსებობის გამო, ეს მაჩვენებლები მოიცავს მნიშვნელობებს 39 გაანალიზებული შემთხვევიდან 38-ისთვის. (D) ზედამხედველობითი კასეტური ანალიზი (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) მორგებული P <0.01) საკონტროლოზე და AD CSF იპოვა ნიმუშები მონაცემთა ნაკრების 65 ყველაზე მნიშვნელოვნად შეცვლილი პროტეინის გამოყენებით. სტანდარტიზაცია, ნორმალიზება.
MAPT-ის პროტეომიური დონე მჭიდრო კავშირშია დამოუკიდებლად გაზომილ ELISA ტაუს დონესთან (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; სურათი 1C), რაც მხარს უჭერს ჩვენი MS გაზომვის ვალიდობას. ტრიპსინის მონელების შემდეგ ამილოიდის წინამორბედი პროტეინის (APP) დონეზე, იზოფორმის სპეციფიური პეპტიდები, რომლებიც შედგენილია Aβ1-40 და Aβ1-42 C-ტერმინალზე, არ შეიძლება ეფექტურად იონიზდეს (27, 28). ამიტომ, ჩვენს მიერ გამოვლენილ APP პეპტიდებს საერთო არაფერი აქვთ ELISA Aβ1-42 დონეებთან. თითოეული შემთხვევის დიფერენციალური გამოხატვის შესაფასებლად, ჩვენ გამოვიყენეთ დიფერენციალურად გამოხატული პროტეინები P <0.0001 [ცრუ აღმოჩენის სიხშირე (FDR) შესწორებული P <0.01] ნიმუშების ზედამხედველობითი კასეტური ანალიზის შესასრულებლად (ცხრილი S2A). როგორც ნაჩვენებია სურათზე 1D, ამ 65 უაღრესად მნიშვნელოვან ცილას შეუძლია სწორად მოაწყოს ნიმუშები დაავადების მდგომარეობის მიხედვით, გარდა AD ერთი შემთხვევისა, კონტროლის მსგავსი მახასიათებლებით. ამ 65 ცილიდან 63 გაიზარდა AD-ში, ხოლო მხოლოდ ორი (CD74 და ISLR) შემცირდა. საერთო ჯამში, ამ ცერებროსპინალური სითხის ანალიზებმა გამოავლინა ასობით ცილა AD-ში, რომლებიც შეიძლება იყოს დაავადების ბიომარკერები.
შემდეგ ჩვენ ჩავატარეთ AD ტვინის პროტეომის დამოუკიდებელი ქსელის ანალიზი. ამ აღმოჩენის ტვინის კოჰორტა მოიცავდა დორსოლატერალური პრეფრონტალური ქერქის (DLPFC) საკონტროლო (n = 10), პარკინსონის დაავადების (PD; n = 10), შერეული AD/PD (n = 10) და AD (n = 10) შემთხვევებს. ) ნიმუში. Emery Goizueta ADRC. ამ 40 შემთხვევის დემოგრაფია ადრე იყო აღწერილი (25) და შეჯამებულია ცხრილში S1B. ჩვენ გამოვიყენეთ TMT-MS ამ 40 ტვინის ქსოვილისა და 27 შემთხვევის რეპლიკაციის კოჰორტის გასაანალიზებლად. საერთო ჯამში, ამ ორი ტვინის მონაცემთა ნაკრები წარმოქმნა 227,121 უნიკალური პეპტიდი, რომლებიც შედგენილი იყო 12,943 პროტეომზე (25). მხოლოდ ის ცილები, რომლებიც რაოდენობრივად იყო განსაზღვრული შემთხვევების სულ მცირე 50%-ში, ჩართული იყო შემდგომ გამოკვლევებში. საბოლოო აღმოჩენის მონაცემთა ნაკრები შეიცავს 8817 რაოდენობრივ პროტეინს. დაარეგულირეთ ცილების სიმრავლის დონე ასაკის, სქესის და სიკვდილის შემდგომი ინტერვალის მიხედვით (PMI). რეგრესიის შემდეგ მონაცემთა ნაკრების დიფერენციალური გამოხატვის ანალიზმა აჩვენა, რომ 2000-ზე მეტი ცილის დონე მნიშვნელოვნად შეიცვალა [P <0.05, ვარიაციის ანალიზი (ANOVA)] დაავადების ორ ან მეტ კოჰორტაში. შემდეგ, ჩვენ ჩავატარეთ ზედამხედველობითი კლასტერული ანალიზი დიფერენციალურად გამოხატული ცილების საფუძველზე და P <0.0001 AD/კონტროლში და/ან AD/PD შედარებებში (სურათი S2, A და B, ცხრილი S2C). ეს 165 ძლიერ შეცვლილი ცილა ნათლად ასახავს AD პათოლოგიის შემთხვევებს საკონტროლო და PD ნიმუშებიდან, რაც ადასტურებს AD-სპეციფიკურ ძლიერ ცვლილებებს მთელ პროტეომში.
შემდეგ ჩვენ გამოვიყენეთ ალგორითმი, სახელწოდებით Weighted Gene Co-Expression Network Analysis (WGCNA), რათა შეგვესრულებინა ქსელის ანალიზი აღმოჩენილ ტვინის პროტეომზე, რომელიც აწყობს მონაცემებს პროტეინის მოდულებში მსგავსი გამოხატვის შაბლონებით (11-13). ანალიზმა გამოავლინა 44 მოდული (M) თანაგამოხატული ცილა, დახარისხებული და დანომრილი უდიდესიდან (M1, n = 1821 ცილა) უმცირესამდე (M44, n = 34 ცილა) (სურათი 2A და ცხრილი S2D) ). როგორც ზემოთ აღინიშნა (13) გამოთვალეთ თითოეული მოდულის წარმომადგენლობითი გამოხატვის პროფილი ან დამახასიათებელი ცილა და დააკავშირეთ იგი დაავადების მდგომარეობასთან და AD პათოლოგიასთან, ანუ დაამყარეთ ალცჰეიმერის დაავადების რეესტრის (CERAD) და Braak Score-ის კავშირი (სურათი 2B). საერთო ჯამში, 17 მოდული მნიშვნელოვნად იყო დაკავშირებული AD ნეიროპათოლოგიასთან (P <0.05). ამ დაავადებასთან დაკავშირებული მრავალი მოდული ასევე მდიდარია უჯრედის ტიპის სპეციფიკური მარკერებით (სურათი 2B). როგორც ზემოთ აღინიშნა (13), უჯრედის ტიპის გამდიდრება განისაზღვრება მოდულის გადახურვისა და უჯრედის ტიპის სპეციფიკური გენების საცნობარო სიის ანალიზით. ეს გენები მიღებულია გამოქვეყნებული მონაცემებიდან თაგვის იზოლირებულ ნეირონებში, ენდოთელურ და გლიურ უჯრედებში. რნმ-ის თანმიმდევრობის (RNA-seq) ექსპერიმენტი (29).
(ა) აღმოაჩინეთ ტვინის პროტეომის WGCNA. (B) ორწონიანი შუაკორელაციური (BiCor) ანალიზი მოდულური ხელმოწერის პროტეინის (მოდულური ცილის ექსპრესიის პირველი ძირითადი კომპონენტი) AD ნეიროპათოლოგიური მახასიათებლებით (ზემოდან), CERAD (Aβ დაფა) და Braak (tau tangles) ქულების ჩათვლით. დადებითი (წითელი) და უარყოფითი (ლურჯი) კორელაციების ინტენსივობა ნაჩვენებია ორფერიანი სითბური რუქით, ხოლო ვარსკვლავები მიუთითებს სტატისტიკურ მნიშვნელობაზე (P <0.05). გამოიყენეთ ჰიპერგეომეტრიული ფიშერის ზუსტი ტესტი (FET) (ქვედა) თითოეული ცილის მოდულის უჯრედის ტიპის ასოციაციის შესაფასებლად. წითელი დაჩრდილვის ინტენსივობა მიუთითებს უჯრედის ტიპის გამდიდრების ხარისხზე, ხოლო ვარსკვლავი მიუთითებს სტატისტიკურ მნიშვნელობაზე (P <0.05). გამოიყენეთ BH მეთოდი FET-დან მიღებული P მნიშვნელობის გამოსასწორებლად. (C) მოდულური ცილების GO ანალიზი. ყველაზე მჭიდროდ დაკავშირებული ბიოლოგიური პროცესები ნაჩვენებია თითოეული მოდულის ან მონათესავე მოდულის ჯგუფისთვის. ოლიგო, ოლიგოდენდროციტი.
ხუთი მჭიდროდ დაკავშირებული ასტროციტებით და მიკროგლიით მდიდარი მოდულის ნაკრები (M30, M29, M18, M24 და M5) აჩვენა ძლიერი დადებითი კორელაცია AD ნეიროპათოლოგიასთან (სურათი 2B). ონტოლოგიური ანალიზი აკავშირებს ამ გლიურ მოდულებს უჯრედების ზრდასთან, პროლიფერაციასთან და იმუნიტეტთან (სურათი 2C და ცხრილი S2E). ორი დამატებითი გლიური მოდული, M8 და M22, ასევე ძლიერ რეგულირდება დაავადების დროს. M8 უაღრესად დაკავშირებულია Toll-ის მსგავსი რეცეპტორების გზასთან, სასიგნალო კასკადთან, რომელიც მთავარ როლს ასრულებს თანდაყოლილ იმუნურ პასუხში (30). ამავდროულად, M22 მჭიდრო კავშირშია თარგმანის შემდგომ მოდიფიკაციასთან. M2, რომელიც მდიდარია ოლიგოდენდროციტებით, აჩვენებს ძლიერ დადებით კორელაციას AD პათოლოგიასთან და ონტოლოგიურ კავშირს ნუკლეოზიდების სინთეზთან და დნმ-ის რეპლიკაციასთან, რაც მიუთითებს დაავადებებში უჯრედების გაძლიერებულ პროლიფერაციაზე. მთლიანობაში, ეს დასკვნები მხარს უჭერს გლიური მოდულების ამაღლებას, რაც ადრე დავაფიქსირეთ AD ქსელის პროტეომში (13, 17). ამჟამად აღმოჩენილია, რომ ქსელში AD-თან დაკავშირებული მრავალი გლიალური მოდული აჩვენებს გამოხატვის დაბალ დონეს საკონტროლო და PD შემთხვევებში, რაც ხაზს უსვამს მათ დაავადების სპეციფიკას, რომელიც ამაღლებულია AD-ში (სურათი S2C).
მხოლოდ ოთხი მოდული ჩვენს ქსელის პროტეომში (M1, M3, M10 და M32) ძლიერ უარყოფითად არის დაკავშირებული AD პათოლოგიასთან (P <0.05) (სურათი 2, B და C). ორივე M1 და M3 მდიდარია ნეირონული მარკერებით. M1 უაღრესად დაკავშირებულია სინაფსურ სიგნალებთან, ხოლო M3 მჭიდრო კავშირშია მიტოქონდრიულ ფუნქციასთან. არ არსებობს M10 და M32 უჯრედის ტიპის გამდიდრების მტკიცებულება. M32 ასახავს კავშირს M3-სა და უჯრედულ მეტაბოლიზმს შორის, ხოლო M10 დიდ კავშირშია უჯრედების ზრდასთან და მიკროტუბულების ფუნქციასთან. AD-თან შედარებით, ოთხივე მოდული გაიზარდა კონტროლსა და PD-ში, რაც მათ აძლევს დაავადების სპეციფიკურ AD ცვლილებებს (სურათი S2C). საერთო ჯამში, ეს შედეგები მხარს უჭერს ნეირონებით მდიდარი მოდულების შემცირებულ სიმრავლეს, რაც ჩვენ ადრე ვნახეთ AD-ში (13, 17). მოკლედ, ტვინის პროტეომის ქსელის ანალიზმა, რომელიც ჩვენ აღმოვაჩინეთ, წარმოქმნა AD-ს სპეციფიკურად შეცვლილი მოდულები, რომლებიც შეესაბამება ჩვენს წინა აღმოჩენებს.
AD ხასიათდება ადრეული ასიმპტომური სტადიით (AsymAD), რომელშიც ინდივიდები აჩვენებენ ამილოიდის დაგროვებას კლინიკური კოგნიტური დაქვეითების გარეშე (5, 31). ეს ასიმპტომური ეტაპი წარმოადგენს კრიტიკულ ფანჯარას ადრეული გამოვლენისა და ჩარევისთვის. ჩვენ ადრე ვაჩვენეთ AsymAD და AD ტვინის ქსელის პროტეომის ძლიერი მოდულური შენარჩუნება მონაცემთა დამოუკიდებელ კომპლექტებში (13, 17). იმისათვის, რომ დავრწმუნდეთ, რომ ტვინის ქსელი, რომელიც ჩვენ ახლა აღმოვაჩინეთ, შეესაბამება ამ წინა აღმოჩენებს, ჩვენ გავაანალიზეთ 44 მოდულის შენახვა 27 DLPFC ორგანიზაციის განმეორებით მონაცემთა ნაკრებში. ეს ორგანიზაციები მოიცავს საკონტროლო (n = 10), AsymAD (n = 8) და AD (n = 9) შემთხვევებს. საკონტროლო და AD ნიმუშები ჩართული იყო ჩვენი აღმოჩენის ტვინის კოჰორტის ანალიზში (ცხრილი S1B), ხოლო AsymAD შემთხვევები უნიკალური იყო მხოლოდ რეპლიკაციის კოჰორტაში. ეს AsymAD შემთხვევები ასევე მოვიდა Emory Goizueta ADRC ტვინის ბანკიდან. მიუხედავად იმისა, რომ შემეცნება ნორმალური იყო სიკვდილის დროს, ამილოიდის დონეები იყო არანორმალურად მაღალი (საშუალო CERAD, 2.8 ± 0.5) (ცხრილი S1B).
ტვინის ამ 27 ქსოვილის TMT-MS ანალიზმა გამოიწვია 11,244 პროტეომის რაოდენობრივი განსაზღვრა. ეს საბოლოო რაოდენობა მოიცავს მხოლოდ იმ ცილებს, რომლებიც რაოდენობრივად არის განსაზღვრული ნიმუშების მინიმუმ 50%-ში. ეს გამეორებული მონაცემთა ნაკრები შეიცავს 8638 (98.0%) 8817 ცილიდან, რომელიც აღმოჩენილია ჩვენი აღმოჩენის ტვინის ანალიზში და აქვს თითქმის 3000 მნიშვნელოვნად შეცვლილი ცილა საკონტროლო და AD კოჰორტებს შორის (P <0.05, Tukey-ის დაწყვილებული t ტესტის შემდეგ ვარიანსის ანალიზისთვის) ( ცხრილი S2F). ამ დიფერენციალურად გამოხატულ პროტეინებს შორის, 910-მა ასევე აჩვენა დონის მნიშვნელოვანი ცვლილებები AD და ტვინის პროტეომის კონტროლის შემთხვევებს შორის (P <0.05, ANOVA Tukey დაწყვილებული t-ტესტის შემდეგ). აღსანიშნავია, რომ ეს 910 მარკერები უაღრესად თანმიმდევრულია პროტეომებს შორის ცვლილების მიმართულებით (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (სურათი S3A). გაზრდილ პროტეინებს შორის, ცილები, რომელთაც აქვთ ყველაზე თანმიმდევრული ცვლილებები მონაცემთა ნაკრებებს შორის, ძირითადად გლიით მდიდარი M5 და M18 მოდულების წევრები არიან (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 და GFAP). შემცირებულ პროტეინებს შორის ყველაზე თანმიმდევრული ცვლილებების მქონენი იყვნენ თითქმის ექსკლუზიურად M1 მოდულის წევრები (NPTX2, VGF და RPH3A), რომლებიც დაკავშირებულია სინაფსებთან. ჩვენ შემდგომ დავადასტურეთ AD-თან დაკავშირებული ცვლილებები midkine (MDK), CD44, გამოყოფილი frizzled დაკავშირებული პროტეინი 1 (SFRP1) და VGF Western blotting-ით (სურათი S3B). მოდულის შენარჩუნების ანალიზმა აჩვენა, რომ ცილის მოდულების (34/44) დაახლოებით 80% თავის ტვინის პროტეომში მნიშვნელოვნად იყო კონსერვირებული რეპლიკაციის მონაცემთა ნაკრებში (z-ქულა> 1.96, FDR შესწორებული P <0.05) (სურათი S3C). ამ მოდულიდან თოთხმეტი სპეციალურად იყო დაცული ორ პროტეომს შორის (z-ქულა> 10, FDR შესწორებული P <1.0 × 10−23). საერთო ჯამში, დიფერენციალური ექსპრესიისა და მოდულური შემადგენლობის მაღალი ხარისხის აღმოჩენა და რეპლიკაცია თავის ტვინის პროტეომებს შორის ხაზს უსვამს AD შუბლის ქერქის ცილებში ცვლილებების განმეორებადობას. გარდა ამისა, მან ასევე დაადასტურა, რომ AsymAD და უფრო მოწინავე დაავადებებს აქვთ ძალიან მსგავსი ტვინის ქსელის სტრუქტურა.
დიფერენციალური ექსპრესიის უფრო დეტალური ანალიზი ტვინის რეპლიკაციის მონაცემთა ნაკრებში ხაზს უსვამს AsymAD ცილის ცვლილებების მნიშვნელოვან ხარისხს, მათ შორის სულ 151 მნიშვნელოვნად შეცვლილი ცილა AsymAD-სა და კონტროლს შორის (P <0.05) (სურათი S3D). ამილოიდური დატვირთვის შესაბამისად, APP ტვინში AsymAD და AD მნიშვნელოვნად გაიზარდა. MAPT მნიშვნელოვნად იცვლება მხოლოდ AD-ში, რაც შეესაბამება ჩახლართების გაზრდილ დონეს და მის ცნობილ კორელაციას კოგნიტურ დაქვეითებასთან (5, 7). გლიით მდიდარი მოდულები (M5 და M18) ძალიან აისახება AsymAD-ში გაზრდილ პროტეინებში, ხოლო ნეირონთან დაკავშირებული M1 მოდული ყველაზე წარმომადგენლობითია AsymAD-ში შემცირებული ცილებისგან. ამ AsymAD მარკერებიდან ბევრი აჩვენებს უფრო დიდ ცვლილებებს სიმპტომურ დაავადებებში. ამ მარკერებს შორის არის SMOC1, გლიური ცილა, რომელიც ეკუთვნის M18-ს, რომელიც დაკავშირებულია ტვინის სიმსივნეებთან და თვალებისა და კიდურების განვითარებასთან (32). MDK არის ჰეპარინის დამაკავშირებელი ზრდის ფაქტორი, რომელიც დაკავშირებულია უჯრედების ზრდასთან და ანგიოგენეზთან (33), M18-ის კიდევ ერთი წევრი. საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით, AsymAD მნიშვნელოვნად გაიზარდა, რასაც მოჰყვა AD-ის უფრო დიდი ზრდა. ამის საპირისპიროდ, სინაფსური ცილა ნეიროპენტრაქსინი 2 (NPTX2) მნიშვნელოვნად შემცირდა AsymAD ტვინში. NPTX2 ადრე ასოცირდებოდა ნეიროდეგენერაციასთან და აქვს აღიარებული როლი ამგზნები სინაფსების შუამავლობაში (34). საერთო ჯამში, ეს შედეგები გამოავლენს სხვადასხვა პრეკლინიკური ცილის ცვლილებებს AD-ში, რომლებიც, როგორც ჩანს, პროგრესირებს დაავადების სიმძიმის მიხედვით.
იმის გათვალისწინებით, რომ ჩვენ მივაღწიეთ ცილის დაფარვის მნიშვნელოვან სიღრმეს ტვინის პროტეომის აღმოჩენისას, ჩვენ ვცდილობთ უფრო სრულად გავიგოთ მისი გადახურვა ქსელის დონის AD ტრანსკრიპტომასთან. ამიტომ, ჩვენ შევადარეთ ჩვენს მიერ აღმოჩენილი ტვინის პროტეომა მოდულს, რომელიც ადრე გენერირებულია 18,204 გენის გაზომვით AD (n = 308) და საკონტროლო (n = 157) DLPFC ქსოვილებში (13). გადახურვა. საერთო ჯამში, ჩვენ გამოვავლინეთ 20 განსხვავებული რნმ მოდული, რომელთაგან ბევრმა აჩვენა უჯრედების სპეციფიკური ტიპების გამდიდრება, მათ შორის ნეირონები, ოლიგოდენდროციტები, ასტროციტები და მიკროგლიები (სურათი 3A). ამ მოდულების მრავალჯერადი ცვლილება AD-ში ნაჩვენებია სურათზე 3B. ჩვენი წინა ცილა-რნმ-ის გადახურვის ანალიზის შესაბამისად უფრო ღრმა არალეგირებული MS პროტეომის გამოყენებით (დაახლოებით 3000 ცილა) (13), ტვინის პროტეომების ქსელში არსებული 44 მოდულიდან უმეტესობა ტრანსკრიპტომის ქსელშია. არ არის მნიშვნელოვანი გადახურვა. 34 ცილის მოდულის ჩვენმა აღმოჩენამ და რეპლიკაციამ, რომლებიც ძალიან შენარჩუნებულია თავის ტვინის პროტეომში, მხოლოდ 14-მა (~40%) გაიარა ფიშერის ზუსტი ტესტი (FET) დაადასტურა, რომ ჰქონდა სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი გადაფარვა ტრანსკრიპტომასთან (სურათი 3A). თავსებადია დნმ-ის დაზიანების შეკეთებასთან (P-M25 და P-M19), ცილების ტრანსლაციასთან (P-M7 და P-M20), რნმ-ის შეკავშირებასთან/დაკავშირებასთან (P-M16 და P-M21) და პროტეინის დამიზნებასთან (P-M13 და P- M23) არ ემთხვევა ტრანსკრიპტომის მოდულებს. ამიტომ, მიუხედავად იმისა, რომ უფრო ღრმა პროტეომის მონაცემთა ნაკრები გამოიყენება მიმდინარე გადახურვის ანალიზში (13), AD ქსელის პროტეომის უმეტესი ნაწილი არ არის შედგენილი ტრანსკრიპტომის ქსელში.
(A) ჰიპერგეომეტრიული FET აჩვენებს უჯრედის ტიპის სპეციფიკური მარკერების გამდიდრებას AD ტრანსკრიპტომის რნმ მოდულში (ზემოდან) და AD ტვინის რნმ (x-ღერძი) და პროტეინის (y-ღერძი) მოდულებს შორის გადაფარვის ხარისხს. (ქვედა). წითელი დაჩრდილვის ინტენსივობა მიუთითებს უჯრედების ტიპების გამდიდრების ხარისხზე ზედა პანელზე და მოდულების გადახურვის ინტენსივობა ქვედა პანელზე. ვარსკვლავი მიუთითებს სტატისტიკურ მნიშვნელობაზე (P <0.05). (B) კორელაციის ხარისხი თითოეული ტრანსკრიპტომის მოდულის დამახასიათებელ გენებსა და AD სტატუსს შორის. მოდულები მარცხნივ ყველაზე უარყოფითად არის დაკავშირებული AD-თან (ლურჯი), ხოლო მარჯვნივ ყველაზე დადებითად არის დაკავშირებული AD-თან (წითელი). log-ტრანსფორმირებული BH-კორექტირებული P მნიშვნელობა მიუთითებს თითოეული კორელაციის სტატისტიკური მნიშვნელოვნების ხარისხზე. (C) მნიშვნელოვანი გადახურვის მოდულები საერთო უჯრედის ტიპის გამდიდრებით. (D) მონიშნული ცილის (x-ღერძი) და რნმ-ის (y-ღერძი) log2-ჯერადი ცვლილების კორელაციური ანალიზი გადახურვის მოდულში. ნაჩვენებია პირსონის კორელაციის კოეფიციენტი შესაბამისი P მნიშვნელობით. მიკრო, მიკროგლია; ციური სხეულები, ასტროციტები. CT, კონტროლი.
გადახურვის პროტეინის და რნმ მოდულების უმეტესობა იზიარებს უჯრედის ტიპის გამდიდრების პროფილებს და თანმიმდევრული AD შეცვლის მიმართულებებს (სურათი 3, B და C). სხვა სიტყვებით რომ ვთქვათ, ტვინის პროტეომის სინაფსებთან დაკავშირებული M1 მოდული (PM​1) შედგენილია სამ ნეირონებით მდიდარ ჰომოლოგიურ რნმ მოდულზე (R-M1, R-M9 და R-M16), რომლებიც AD ორივე აჩვენა. შემცირებული დონე. ანალოგიურად, გლიით მდიდარი M5 და M18 პროტეინის მოდულები ემთხვევა რნმ-ის მოდულებს, რომლებიც მდიდარა ასტროციტებითა და მიკროგლიური მარკერებით (R-M3, R-M7 და R-M10) და დიდად მონაწილეობენ დაავადების ზრდაში. ეს გაზიარებული მოდულური ფუნქციები მონაცემთა ორ ნაკრებს შორის კიდევ უფრო უჭერს მხარს უჯრედის ტიპის გამდიდრებას და დაავადებებთან დაკავშირებულ ცვლილებებს, რომლებიც ჩვენ დავაფიქსირეთ ტვინის პროტეომში. თუმცა, ჩვენ დავაფიქსირეთ ბევრი მნიშვნელოვანი განსხვავება ცალკეული მარკერების რნმ-სა და ცილის დონეებს შორის ამ საერთო მოდულებში. მოლეკულების პროტეომიკისა და ტრანსკრიპტომიკის დიფერენციალური გამოხატვის კორელაციური ანალიზი ამ გადახურვის მოდულებში (სურათი 3D) ხაზს უსვამს ამ შეუსაბამობას. მაგალითად, APP-მ და სხვა გლიური მოდულის პროტეინებმა (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 და SFRP1) აჩვენეს AD პროტეომის მნიშვნელოვანი ზრდა, მაგრამ თითქმის არ იყო ცვლილება AD ტრანსკრიპტომში. ეს პროტეინის სპეციფიკური ცვლილებები შეიძლება მჭიდროდ იყოს დაკავშირებული ამილოიდურ დაფებთან (23, 35), რაც ხაზს უსვამს პროტეომს, როგორც პათოლოგიური ცვლილებების წყაროს, და ეს ცვლილებები შეიძლება არ აისახოს ტრანსკრიპტომში.
ჩვენ მიერ აღმოჩენილი ტვინისა და CSF პროტეომების დამოუკიდებელი ანალიზის შემდეგ, ჩვენ ჩავატარეთ მონაცემთა ორი ნაკრების ყოვლისმომცველი ანალიზი AD CSF ბიომარკერების დასადგენად, რომლებიც დაკავშირებულია ტვინის ქსელის პათოფიზიოლოგიასთან. ჯერ უნდა განვსაზღვროთ ორი პროტეომის გადახურვა. მიუხედავად იმისა, რომ ფართოდ არის მიღებული, რომ CSF ასახავს ნეიროქიმიურ ცვლილებებს AD ტვინში (4), AD ტვინსა და CSF პროტეომს შორის გადახურვის ზუსტი ხარისხი გაურკვეველია. ჩვენს ორ პროტეომში გამოვლენილი საერთო გენის პროდუქტების რაოდენობის შედარებით, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ცერებროსპინალურ სითხეში გამოვლენილი ცილების თითქმის 70% (n = 1936) ასევე რაოდენობრივად იყო განსაზღვრული ტვინში (სურათი 4A). ამ გადაფარვითი ცილების უმეტესობა (n = 1721) შედგენილია 44 თანაგამოხატვის მოდულიდან ერთ-ერთში აღმოჩენის ტვინის მონაცემთა ნაკრებიდან (სურათი 4B). როგორც მოსალოდნელი იყო, ტვინის ექვსმა უდიდესმა მოდულმა (M1-დან M6-მდე) აჩვენა CSF-ის გადახურვის უდიდესი რაოდენობა. თუმცა, არსებობს ტვინის უფრო მცირე მოდულები (მაგალითად, M15 და M29), რომლებიც აღწევენ გადახურვის მოულოდნელად მაღალ ხარისხს, რაც აღემატება ტვინის მოდულს ორჯერ მის ზომაზე. ეს გვაძლევს მოტივაციას მივიღოთ უფრო დეტალური, სტატისტიკურად ორიენტირებული მეთოდი ტვინსა და ცერებროსპინალურ სითხეს შორის გადახურვის გამოსათვლელად.
(A და B) აღმოჩენის ტვინისა და CSF მონაცემთა ნაკრებებში აღმოჩენილი ცილები ერთმანეთს ემთხვევა. ამ გადახურული ცილების უმეტესობა დაკავშირებულია ტვინის თანაგამოხატვის ქსელის 44 თანაგამოხატვის მოდულიდან ერთ-ერთთან. (C) აღმოაჩინეთ გადახურვა ცერებროსპინალური სითხის პროტეომასა და ტვინის ქსელის პროტეომს შორის. სითბოს რუქის თითოეული მწკრივი წარმოადგენს ჰიპერგეომეტრიული FET-ის ცალკე გადახურვის ანალიზს. ზედა მწკრივი ასახავს გადახურვას (ნაცრისფერი/შავი დაჩრდილვა) ტვინის მოდულსა და მთლიან CSF პროტეომს შორის. მეორე სტრიქონი ასახავს, ​​რომ ტვინის მოდულებსა და CSF პროტეინს შორის (წითლად დაჩრდილული) გადაფარვა მნიშვნელოვნად რეგულირდება AD-ში (P <0.05). მესამე მწკრივი აჩვენებს, რომ ტვინის მოდულებსა და CSF პროტეინს შორის გადაფარვა (ლურჯი დაჩრდილვა) მნიშვნელოვნად დაქვეითებულია AD-ში (P <0.05). გამოიყენეთ BH მეთოდი FET-დან მიღებული P მნიშვნელობის გამოსასწორებლად. (D) დასაკეცი მოდულის პანელი, რომელიც დაფუძნებულია უჯრედის ტიპის ასოციაციაზე და მასთან დაკავშირებულ GO ტერმინებზე. ეს პანელები შეიცავს სულ 271 ტვინთან დაკავშირებულ ცილას, რომლებსაც აქვთ მნიშვნელოვანი დიფერენციალური გამოხატულება CSF პროტეომში.
ერთკუდიანი FET-ების გამოყენებით, ჩვენ შევაფასეთ ცილის გადაფარვის მნიშვნელობა CSF პროტეომსა და ტვინის ცალკეულ მოდულებს შორის. ანალიზმა აჩვენა, რომ CSF მონაცემთა ნაკრების სულ 14 ტვინის მოდულს აქვს სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი გადახურვა (FDR მორგებული P <0.05) და დამატებით მოდულს (M18), რომლის გადახურვა ახლოსაა მნიშვნელობასთან (FDR მორგებული P = 0.06) (სურათი 4C). ზედა რიგი). ჩვენ ასევე გვაინტერესებს მოდულები, რომლებიც ძლიერ ემთხვევა დიფერენციალურად გამოხატულ CSF პროტეინებს. ამიტომ, ჩვენ გამოვიყენეთ ორი დამატებითი FET ანალიზი, რათა განვსაზღვროთ, რომელი (i) CSF ცილა იყო მნიშვნელოვნად გაიზარდა AD-ში და (ii) CSF ცილა მნიშვნელოვნად შემცირდა AD-ში (P <0.05, დაწყვილებული t ტესტი AD/კონტროლი) ტვინის მოდულები მნიშვნელოვანი გადახურვით. მათ შორის. როგორც ნაჩვენებია სურათი 4C-ის შუა და ქვედა რიგებში, ეს დამატებითი ანალიზები აჩვენებს, რომ ტვინის 44 მოდულიდან 8 მნიშვნელოვნად ემთხვევა AD CSF-ში დამატებულ ცილას (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 და M38) . ), მაშინ როცა მხოლოდ ორმა მოდულმა (M6 და M15) აჩვენა მნიშვნელოვანი გადახურვა შემცირებულ პროტეინთან AD CSF-ში. როგორც მოსალოდნელი იყო, 10-ვე მოდული არის 15 მოდულში ყველაზე მაღალი გადახურვით CSF პროტეომთან. ამიტომ, ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ ეს 15 მოდული არის AD ტვინისგან მიღებული CSF ბიომარკერების მაღალი პროდუქტიულობის წყაროები.
ჩვენ დავკეცეთ ეს 15 გადახურული მოდული ხუთ დიდ ცილოვან პანელში, WGCNA ხის დიაგრამაში მათი სიახლოვისა და უჯრედების ტიპებთან და გენის ონტოლოგიასთან მათი კავშირის საფუძველზე (სურათი 4D). პირველი პანელი შეიცავს ნეირონების მარკერებითა და სინაფსებთან დაკავშირებული პროტეინებით მდიდარ მოდულებს (M1 და M12). სინაფსური პანელი შეიცავს სულ 94 ცილას და დონეები CSF პროტეომში მნიშვნელოვნად შეიცვალა, რაც მას ხუთ პანელს შორის ტვინთან დაკავშირებული CSF მარკერების უდიდეს წყაროდ აქცევს. მეორე ჯგუფმა (M6 და M15) აჩვენა მჭიდრო კავშირი ენდოთელური უჯრედების მარკერებთან და სისხლძარღვთა სხეულთან, როგორიცაა "ჭრილობის შეხორცება" (M6) და "ჰუმორული იმუნური პასუხის რეგულირება" (M15). M15 ასევე დიდ კავშირშია ლიპოპროტეინების მეტაბოლიზმთან, რომელიც მჭიდროდ არის დაკავშირებული ენდოთელიუმთან (36). სისხლძარღვთა პანელი შეიცავს ტვინთან დაკავშირებულ 34 CSF მარკერს. მესამე ჯგუფში შედის მოდულები (M2 და M4), რომლებიც მნიშვნელოვნად არის დაკავშირებული ოლიგოდენდროციტების მარკერებთან და უჯრედების პროლიფერაციასთან. მაგალითად, M2-ის უმაღლესი დონის ონტოლოგიის ტერმინები მოიცავს „დნმ-ის რეპლიკაციის პოზიტიურ რეგულირებას“ და „პურინის ბიოსინთეზის პროცესს“. იმავდროულად, M4-ში შედის "გლიური უჯრედების დიფერენციაცია" და "ქრომოსომის სეგრეგაცია". მიელინაციური პანელი შეიცავს 49 CSF მარკერს, რომლებიც დაკავშირებულია ტვინთან.
მეოთხე ჯგუფი შეიცავს ყველაზე მეტ მოდულს (M30, M29, M18, M24 და M5) და თითქმის ყველა მოდული საგრძნობლად მდიდარია მიკროგლიითა და ასტროციტების მარკერებით. მიელინაციური პანელის მსგავსად, მეოთხე პანელი ასევე შეიცავს მოდულებს (M30, M29 და M18), რომლებიც მჭიდრო კავშირშია უჯრედების პროლიფერაციასთან. ამ ჯგუფის სხვა მოდულები უაღრესად დაკავშირებულია იმუნოლოგიურ ტერმინებთან, როგორიცაა „იმუნური ეფექტის პროცესი“ (M5) და „იმუნური პასუხის რეგულირება“ (M24). გლიური იმუნური ჯგუფი შეიცავს 42 CSF მარკერს, რომლებიც დაკავშირებულია ტვინთან. დაბოლოს, ბოლო პანელი მოიცავს 52 ტვინთან დაკავშირებულ მარკერს ოთხ მოდულზე (M44, M3, M33 და M38), ყველა მათგანი სხეულზეა დაკავშირებული ენერგიის შენახვასა და მეტაბოლიზმთან. ამ მოდულიდან ყველაზე დიდი (M3) მჭიდროდ არის დაკავშირებული მიტოქონდრიასთან და მდიდარია ნეირონისთვის სპეციფიკური მარკერებით. M38 არის ერთ-ერთი პატარა მოდულის წევრი ამ მეტაბოლომში და ასევე ავლენს ნეირონების ზომიერ სპეციფიკას.
საერთო ჯამში, ეს ხუთი პანელი ასახავს უჯრედების ტიპებისა და ფუნქციების ფართო სპექტრს AD ქერქში და ერთობლივად შეიცავს 271 ტვინთან დაკავშირებულ CSF მარკერს (ცხრილი S2G). ამ MS შედეგების ვალიდურობის შესაფასებლად, ჩვენ გამოვიყენეთ სიახლოვის გაფართოების ანალიზი (PEA), ორთოგონალური ანტისხეულზე დაფუძნებული ტექნოლოგია მულტიპლექსირების შესაძლებლობებით, მაღალი მგრძნობელობითა და სპეციფიკურობით და გავაანალიზეთ თავზურგტვინის სითხის ნიმუშები, რომლებიც აღმოვაჩინეთ ამ 271 ბიომარკერის ქვეჯგუფი. (n = 36). ეს 36 სამიზნე აჩვენებს ცვლილებას PEA-ს AD მრავლობითში, რომელიც მჭიდრო კავშირშია ჩვენს MS-ზე დაფუძნებულ დასკვნებთან (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), რაც მტკიცედ ადასტურებს ჩვენი ყოვლისმომცველი MS ანალიზის შედეგებს (სურათი S4 ).
ჩვენი ხუთი ჯგუფის მიერ ხაზგასმული ბიოლოგიური თემები, სინაფსური სიგნალიდან ენერგიის მეტაბოლიზმამდე, ყველა დაკავშირებულია AD-ის პათოგენეზთან (1-3). ამრიგად, ამ პანელების შემცველი 15-ვე მოდული დაკავშირებულია AD პათოლოგიასთან თავის ტვინის პროტეომში, რომელიც ჩვენ აღმოვაჩინეთ (სურათი 2B). ყველაზე აღსანიშნავი არის მაღალი დადებითი პათოლოგიური კორელაცია ჩვენს გლიურ მოდულებს შორის და ძლიერი უარყოფითი პათოლოგიური კორელაცია ჩვენს უდიდეს ნეირონულ მოდულებს შორის (M1 და M3). ჩვენი განმეორებადი ტვინის პროტეომის დიფერენციალური გამოხატვის ანალიზი (სურათი S3D) ასევე ხაზს უსვამს M5 და M18-დან მიღებულ გლიურ პროტეინებს. AsymAD-ში და სიმპტომურ AD-ში, ყველაზე მეტად გაზრდილი გლიური ცილები და M1-თან დაკავშირებული სინაფსები. ცილა ყველაზე მეტად მცირდება. ეს დაკვირვებები მიუთითებს, რომ 271 ცერებროსპინალური სითხის მარკერები, რომლებიც ჩვენ გამოვავლინეთ ხუთ ჯგუფში, დაკავშირებულია დაავადების პროცესებთან AD ქერქში, მათ შორის, რაც ხდება ადრეულ ასიმპტომურ ეტაპებზე.
ტვინში და ზურგის სითხეში პანელის ცილების ცვლილების მიმართულების უკეთ გასაანალიზებლად, ჩვენ დავხატეთ შემდეგი 15 გადახურული მოდულიდან თითოეული: (i) ვიპოვნეთ მოდულის სიმრავლის დონე ტვინის მონაცემთა ნაკრებში და (ii) მოდული. ცილა განსხვავება გამოხატულია ცერებროსპინალურ სითხეში (სურათი S5). როგორც უკვე აღვნიშნეთ, WGCNA გამოიყენება ტვინში მოდულის სიმრავლის ან დამახასიათებელი ცილის მნიშვნელობის დასადგენად (13). ვულკანის რუკა გამოიყენება ცერებროსპინალურ სითხეში მოდულური ცილების დიფერენციალური გამოხატვის აღსაწერად (AD/კონტროლი). ეს ფიგურები აჩვენებს, რომ ხუთი პანელიდან სამი აჩვენებს თავის ტვინსა და ზურგის სითხეში გამოხატვის განსხვავებულ ტენდენციებს. სინაფსური პანელის ორი მოდული (M1 და M12) აჩვენებს AD ტვინში სიმრავლის დონის შემცირებას, მაგრამ მნიშვნელოვნად ემთხვევა AD CSF-ში გაზრდილ ცილას (სურათი S5A). ნეირონთან დაკავშირებული მოდულები, რომლებიც შეიცავს მეტაბოლიმს (M3 და M38) აჩვენებდნენ ტვინის და ცერებროსპინალური სითხის მსგავსი ექსპრესიის შაბლონებს, რომლებიც არათანმიმდევრულია (სურათი S5E). სისხლძარღვთა პანელმა ასევე აჩვენა გამოხატვის განსხვავებული ტენდენციები, თუმცა მისი მოდულები (M6 და M15) ზომიერად გაიზარდა AD ტვინში და შემცირდა დაავადებულ CSF-ში (სურათი S5B). დანარჩენი ორი პანელი შეიცავს დიდ გლიურ ქსელებს, რომელთა ცილები მუდმივად რეგულირდება ორივე განყოფილებაში (სურათი S5, C და D).
გთხოვთ გაითვალისწინოთ, რომ ეს ტენდენციები არ არის საერთო ამ პანელების ყველა მარკერისთვის. მაგალითად, სინაფსური პანელი მოიცავს რამდენიმე ცილას, რომლებიც მნიშვნელოვნად შემცირებულია AD ტვინში და CSF-ში (სურათი S5A). ამ დაქვეითებულ ცერებროსპინალური სითხის მარკერებს შორის არის NPTX2 და VGF M1 და ქრომოგრანი B M12. თუმცა, მიუხედავად ამ გამონაკლისებისა, ჩვენი სინაფსური მარკერების უმეტესობა ამაღლებულია AD ზურგის სითხეში. საერთო ჯამში, ამ ანალიზებმა შეძლეს გამოეყოთ სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი ტენდენციები თავის ტვინისა და ცერებროსპინალური სითხის დონეებში ჩვენს ხუთ პანელში. ეს ტენდენციები ხაზს უსვამს რთულ და ხშირად განსხვავებულ ურთიერთობას ტვინისა და CSF ცილის ექსპრესიას შორის AD-ში.
შემდეგ, ჩვენ გამოვიყენეთ მაღალი გამტარუნარიანობის MS რეპლიკაციის ანალიზი (CSF რეპლიკაცია 1), რათა შევამციროთ ჩვენი 271 ბიომარკერების ნაკრები ყველაზე პერსპექტიულ და რეპროდუცირებად სამიზნეებამდე (სურათი 5A). CSF ასლი 1 შეიცავს სულ 96 ნიმუშს Emory Goizueta ADRC-დან, მათ შორის საკონტროლო, AsymAD და AD კოჰორტა (ცხრილი S1A). AD-ს ამ შემთხვევებს ახასიათებს მსუბუქი კოგნიტური დაქვეითება (საშუალო MoCA, 20.0 ± 3.8) და AD ბიომარკერების ცვლილებები დადასტურებული ცერებროსპინალურ სითხეში (ცხრილი S1A). ჩვენს მიერ აღმოჩენილი CSF ანალიზის საწინააღმდეგოდ, ეს რეპლიკაცია ხორციელდება უფრო ეფექტური და მაღალი გამტარუნარიანობის "ერთჯერადი" MS მეთოდის გამოყენებით (ხაზგარეშე დანაწილების გარეშე), ნიმუშის მომზადების გამარტივებული პროტოკოლის ჩათვლით, რომელიც გამორიცხავს ცალკეული ნიმუშების იმუნოდეფიციტის საჭიროებას. . ამის ნაცვლად, ერთი იმუნური დაქვეითებული „გაძლიერების არხი“ გამოიყენება ნაკლებად უხვი ცილების სიგნალის გასაძლიერებლად (37). მიუხედავად იმისა, რომ ამცირებს მთლიანი პროტეომის დაფარვას, ეს ერთჯერადი გასროლის მეთოდი მნიშვნელოვნად ამცირებს აპარატის დროს და ზრდის TMT-ით მარკირებული ნიმუშების რაოდენობას, რომლებიც შეიძლება გაანალიზდეს სიცოცხლისუნარიანად (17, 38). საერთო ჯამში, ანალიზმა გამოავლინა 6,487 პეპტიდი, რომლებიც 96 შემთხვევაში 1,183 პროტეომს შეადგენდნენ. როგორც ჩვენ აღმოვაჩინეთ CSF ანალიზისას, მხოლოდ ის პროტეინები, რომლებიც რაოდენობრივად იქნა შეფასებული ნიმუშების სულ მცირე 50%-ში, ჩართული იყო შემდგომ გამოთვლებში და მონაცემები რეგრესირებული იყო ასაკისა და სქესის ეფექტებისთვის. ამან გამოიწვია 792 პროტეომის საბოლოო რაოდენობრივი განსაზღვრა, რომელთა 95% ასევე იდენტიფიცირებული იყო CSF მონაცემთა ნაკრებში.
(A) ტვინთან დაკავშირებული CSF პროტეინის სამიზნეები დამოწმებული CSF-ის პირველ რეპლიკაციურ კოჰორტაში და ჩართული საბოლოო პანელში (n = 60). (B-დან E) პანელის ბიომარკერების დონეები (კომპოზიტური z-ქულები) გაზომილი CSF-ის რეპლიკაციის ოთხ კოჰორტაში. დაწყვილებული t-ტესტები ან ANOVA Tukey-ის პოსტ-კორექტირებასთან ერთად გამოყენებული იყო სიმრავლის ცვლილებების სტატისტიკური მნიშვნელობის შესაფასებლად თითოეულ რეპლიკაციულ ანალიზში. CT, კონტროლი.
ვინაიდან ჩვენ განსაკუთრებით გვაინტერესებს 271 ტვინთან დაკავშირებული CSF სამიზნის დადასტურება ყოვლისმომცველი ანალიზის მეშვეობით, ჩვენ ამ რეპლიკირებული პროტეომის შემდგომ გამოკვლევას ამ მარკერებით შევზღუდავთ. ამ 271 ცილას შორის, 100 გამოვლინდა CSF რეპლიკაციაში 1. სურათი S6A გვიჩვენებს ამ 100 გადაფარვის მარკერის დიფერენციალურ გამოხატულებას საკონტროლო და AD რეპლიკაციის ნიმუშებს შორის. სინაფსური და მეტაბოლიტური ჰისტონები ყველაზე მეტად იზრდება AD-ში, ხოლო სისხლძარღვთა ცილები ყველაზე მეტად მცირდება დაავადების დროს. 100 გადახურვის მარკერის უმეტესობამ (n = 70) შეინარჩუნა ცვლილების იგივე მიმართულება მონაცემთა ორ ნაკრებში (სურათი S6B). ეს 70 დადასტურებული ტვინთან დაკავშირებული CSF მარკერი (ცხრილი S2H) დიდწილად ასახავს ადრე დაკვირვებულ პანელის ექსპრესიის ტენდენციებს, ანუ სისხლძარღვთა ცილების დაქვეითებას და ყველა სხვა პანელების მაღლა რეგულირებას. ამ 70 დადასტურებული ცილიდან მხოლოდ 10-მა აჩვენა ცვლილებები AD სიმრავლეში, რაც ეწინააღმდეგებოდა ამ პანელის ტენდენციებს. იმისათვის, რომ შეიქმნას პანელი, რომელიც საუკეთესოდ ასახავს ტვინისა და ცერებროსპინალური სითხის საერთო ტენდენციას, ჩვენ გამოვრიცხეთ ეს 10 ცილა საინტერესო პანელიდან, რომელიც საბოლოოდ შევამოწმეთ (სურათი 5A). ამიტომ, ჩვენი პანელი საბოლოოდ მოიცავს სულ 60 ცილას, დამოწმებულ ორ დამოუკიდებელ CSF AD კოჰორტაში სხვადასხვა ნიმუშის მომზადებისა და MS პლატფორმის ანალიზის გამოყენებით. ამ საბოლოო პანელების z-ქულის გამოხატვის ნახაზები CSF ასლის 1 საკონტროლო და AD შემთხვევებში დაადასტურა პანელის ტენდენცია, რომელიც დაფიქსირდა ჩვენს მიერ ნაპოვნი CSF კოჰორტაში (სურათი 5B).
ამ 60 ცილას შორის ცნობილია AD-თან დაკავშირებული მოლეკულები, როგორიცაა ოსტეოპონტინი (SPP1), რომელიც არის ანთების პრო-ანთებითი ციტოკინი, რომელიც დაკავშირებულია AD-თან მრავალ კვლევაში (39-41) და GAP43, სინაფსური ცილა. რაც აშკარად უკავშირდება ნეიროდეგენერაციას (42). ყველაზე სრულად დამოწმებული ცილები არის მარკერები, რომლებიც დაკავშირებულია სხვა ნეიროდეგენერაციულ დაავადებებთან, როგორიცაა ამიოტროფიული გვერდითი სკლეროზი (ALS) დაკავშირებული სუპეროქსიდის დისმუტაზა 1 (SOD1) და პარკინსონის დაავადებასთან დაკავშირებული დესაქარაზა (PARK7). ჩვენ ასევე დავადასტურეთ, რომ ბევრ სხვა მარკერს, როგორიცაა SMOC1 და ტვინით მდიდარი მემბრანის მიმაგრების სასიგნალო პროტეინი 1 (BASP1), ზღუდავდა წინა კავშირებს ნეიროდეგენერაციასთან. აღსანიშნავია, რომ CSF პროტეომში მათი დაბალი სიმრავლის გამო, ჩვენთვის ძნელია გამოვიყენოთ ეს მაღალი გამტარუნარიანობის ერთჯერადი გამოვლენის მეთოდი, რათა საიმედოდ აღმოვაჩინოთ MAPT და AD-თან დაკავშირებული ზოგიერთი სხვა პროტეინი (მაგალითად, NEFL და NRGN ) (43, 44).
ჩვენ შემდეგ შევამოწმეთ ეს 60 პრიორიტეტული პანელის მარკერი სამ დამატებით განმეორებით ანალიზში. CSF ასლი 2-ში ჩვენ გამოვიყენეთ ერთი TMT-MS 297 კონტროლისა და AD ნიმუშების დამოუკიდებელი კოჰორტის გასაანალიზებლად Emory Goizueta ADRC-დან (17). CSF რეპლიკაცია 3 მოიცავდა ხელმისაწვდომი TMT-MS მონაცემების ხელახლა ანალიზს 120 კონტროლისა და AD პაციენტისგან ლოზანიდან, შვეიცარია (45). ჩვენ აღმოვაჩინეთ 60 პრიორიტეტული მარკერის ორ მესამედზე მეტი თითოეულ მონაცემთა ბაზაში. მიუხედავად იმისა, რომ შვეიცარიულმა კვლევამ გამოიყენა სხვადასხვა MS პლატფორმა და TMT რაოდენობრივი მეთოდები (45, 46), ჩვენ მკაცრად გავამრავლეთ ჩვენი პანელის ტენდენციები ორ განმეორებით ანალიზში (სურათი 5, C და D, და ცხრილები S2, I და J). ჩვენი ჯგუფის დაავადების სპეციფიკის შესაფასებლად, ჩვენ გამოვიყენეთ TMT-MS მეოთხე რეპლიკაციის მონაცემთა ნაკრების გასაანალიზებლად (CSF რეპლიკაცია 4), რომელიც მოიცავდა არა მხოლოდ საკონტროლო (n = 18) და AD (n = 17) შემთხვევებს, არამედ PD ( n = 14)), ALS (n = 18) და ფრონტტემპორალური დემენციის (FTD) ნიმუშები (n = 11) (ცხრილი S1A). ჩვენ წარმატებით გავზომეთ პანელის ცილების თითქმის ორი მესამედი ამ კოჰორტაში (38 60-დან). ეს შედეგები ხაზს უსვამს AD-ს სპეციფიკურ ცვლილებებს ხუთივე ბიომარკერის პანელში (სურათი 5E და ცხრილი S2K). მეტაბოლიტების ჯგუფში მატებამ აჩვენა AD-ს ყველაზე ძლიერი სპეციფიკა, რასაც მოჰყვა მიელინაცია და გლიური ჯგუფი. უფრო მცირე ზომით, FTD ასევე აჩვენებს ზრდას ამ პანელებს შორის, რაც შეიძლება ასახავდეს ქსელის მსგავს პოტენციურ ცვლილებებს (17). ამის საპირისპიროდ, ALS და PD აჩვენებდნენ თითქმის იგივე მიელინაციის, გლიური და მეტაბოლომის პროფილებს, როგორც საკონტროლო ჯგუფს. მთლიანობაში, ნიმუშების მომზადების, MS პლატფორმისა და TMT რაოდენობრივი მეთოდების განსხვავებების მიუხედავად, ეს განმეორებითი ანალიზები აჩვენებს, რომ ჩვენი პრიორიტეტული პანელის მარკერებს აქვთ მაღალი თანმიმდევრული AD-სპეციფიკური ცვლილებები 500-ზე მეტ უნიკალურ CSF ნიმუშში.
AD ნეიროდეგენერაცია ფართოდ იქნა აღიარებული კოგნიტური სიმპტომების დაწყებამდე რამდენიმე წლით ადრე, ამიტომ არის გადაუდებელი საჭიროება AsymAD-ის ბიომარკერებისთვის (5, 31). თუმცა, უფრო და უფრო მეტი მტკიცებულება აჩვენებს, რომ AsymAD-ის ბიოლოგია შორს არის ჰომოგენურისგან და რისკისა და გამძლეობის კომპლექსური ურთიერთქმედება იწვევს დიდ ინდივიდუალურ განსხვავებებს დაავადების შემდგომ პროგრესირებაში (47). მიუხედავად იმისა, რომ გამოიყენება AsymAD-ის შემთხვევების იდენტიფიცირებისთვის, CSF-ის ძირითადი ბიომარკერების დონეები (Aβ1-42, მთლიანი ტაუ და p-tau) არ დადასტურდა, რომ შეუძლია საიმედოდ წინასწარ განსაზღვროს, თუ ვინ გადავა დემენციაში (4, 7), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ეს შეიძლება იყოს აუცილებელია შეიცავდეს ჰოლისტიკური ბიომარკერების ხელსაწყოებს, რომლებიც დაფუძნებულია ტვინის ფიზიოლოგიის მრავალ ასპექტზე, ამ პოპულაციის რისკის ზუსტად სტრატიფიკაციისთვის. ამიტომ, ჩვენ შემდგომ გავაანალიზეთ ჩვენი AD-ით დადასტურებული ბიომარკერის პანელი CSF ასლის 1-ის AsymAD პოპულაციაში. ამ 31 AsymAD შემთხვევამ აჩვენა ძირითადი ბიომარკერის არანორმალური დონე (Aβ1–42/ტოტალური tau ELISA თანაფარდობა, <5.5) და სრული შემეცნება (საშუალო MoCA, 271. ± 2.2) (ცხრილი S1A). გარდა ამისა, AsymAD-ის მქონე ყველა ინდივიდს აქვს კლინიკური დემენციის ქულა 0, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ არ არსებობს მტკიცებულება ყოველდღიური კოგნიტური ან ფუნქციური მუშაობის დაქვეითების შესახებ.
ჩვენ პირველად გავაანალიზეთ დადასტურებული პანელების დონეები ყველა 96 CSF რეპლიკაში 1, მათ შორის AsymAD კოჰორტაში. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ AsymAD ჯგუფში რამდენიმე პანელს ჰქონდა AD-ის მსგავსი სიმრავლის მნიშვნელოვანი ცვლილებები, სისხლძარღვთა პანელმა აჩვენა დაღმავალი ტენდენცია AsymAD-ში, ხოლო ყველა სხვა პანელმა აჩვენა აღმავალი ტენდენცია (სურათი 6A). ამიტომ, ყველა პანელმა აჩვენა უაღრესად მნიშვნელოვანი კორელაცია ELISA Aβ1-42 და საერთო ტაუს დონეებთან (სურათი 6B). ამის საპირისპიროდ, ჯგუფსა და სამინისტროს ქულას შორის კორელაცია შედარებით ცუდია. ამ ანალიზის ერთ-ერთი ყველაზე გასაოცარი დასკვნა არის პანელის სიმრავლის დიდი დიაპაზონი AsymAD კოჰორტაში. როგორც ნაჩვენებია სურათზე 6A, AsymAD ჯგუფის პანელის დონე ჩვეულებრივ კვეთს საკონტროლო ჯგუფისა და AD ჯგუფის პანელის დონეს, რაც აჩვენებს შედარებით მაღალ ცვალებადობას. AsymAD-ის ამ ჰეტეროგენურობის შემდგომი შესასწავლად, ჩვენ გამოვიყენეთ მრავალგანზომილებიანი სკალირების (MDS) ანალიზი 96 CSF რეპლიკაციის 1 შემთხვევაში. MDS ანალიზი საშუალებას გაძლევთ ვიზუალურად წარმოიდგინოთ მსგავსება შემთხვევებს შორის მონაცემთა ნაკრების გარკვეულ ცვლადებზე დაყრდნობით. ამ კლასტერული ანალიზისთვის ჩვენ ვიყენებთ მხოლოდ იმ დადასტურებულ პანელის მარკერებს, რომლებსაც აქვთ სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი ცვლილება (P <0.05, AD/კონტროლი) CSF აღმოჩენისა და რეპლიკაციის 1 პროტეომის (n = 29) (ცხრილი S2L) დონეზე. ამ ანალიზმა წარმოქმნა ნათელი სივრცითი კლასტერირება ჩვენს კონტროლსა და AD შემთხვევებს შორის (სურათი 6C). ამის საპირისპიროდ, ზოგიერთი AsymAD შემთხვევა აშკარად არის დაჯგუფებული საკონტროლო ჯგუფში, ხოლო სხვები განლაგებულია AD შემთხვევებში. ამ AsymAD ჰეტეროგენურობის შემდგომი შესასწავლად, ჩვენ გამოვიყენეთ ჩვენი MDS რუკა ამ AsymAD შემთხვევების ორი ჯგუფის დასადგენად. პირველ ჯგუფში მოიცავდა AsymAD შემთხვევებს, რომლებიც უფრო ახლოს იყო კონტროლთან (n = 19), ხოლო მეორე ჯგუფს ახასიათებდა AsymAD შემთხვევები AD-სთან უფრო ახლოს მარკერის პროფილით (n = 12).
(A) CSF ბიომარკერების ჯგუფის გამოხატვის დონე (z-ქულა) 96-ვე ნიმუშში CSF რეპლიკაციის 1 კოჰორტაში, AsymAD-ის ჩათვლით. დისპერსიის ანალიზი ტუკის პოსტ-კორექტირებით გამოყენებული იყო პანელის სიმრავლის ცვლილებების სტატისტიკური მნიშვნელობის შესაფასებლად. (B) პანელის ცილების სიმრავლის დონის (z-ქულა) კორელაციური ანალიზი MoCA ქულასთან და საერთო ტაუს დონესთან ELISA Aβ1-42 და CSF ასლის 1 ნიმუშებში. ნაჩვენებია პირსონის კორელაციის კოეფიციენტი შესაბამისი P მნიშვნელობით. (C) CSF 96 ასლი 1 შემთხვევის MDS დაფუძნებული იყო 29 დადასტურებული პანელის მარკერების სიმრავლის დონეზე, რომლებიც მნიშვნელოვნად შეიცვალა როგორც აღმოჩენის, ასევე CSF ასლის 1 მონაცემთა ნაკრებში [P <0.05 AD/კონტროლი (CT)]. ეს ანალიზი გამოიყენებოდა AsymAD ჯგუფის საკონტროლო (n = 19) და AD (n = 12) ქვეჯგუფებად დასაყოფად. (D) ვულკანის დიაგრამა გვიჩვენებს ყველა CSF რეპლიკაციის 1 ცილების დიფერენციალურ გამოხატულებას log2-ჯერადი ცვლილებით (x-ღერძი) -log10 სტატისტიკურ P მნიშვნელობასთან მიმართებაში AsymAD ორ ქვეჯგუფს შორის. პანელის ბიომარკერები ფერადია. (E) შერჩევის ჯგუფის ბიომარკერების CSF რეპლიკაციის 1 სიმრავლის დონე განსხვავებულად არის გამოხატული AsymAD ქვეჯგუფებს შორის. სტატისტიკური მნიშვნელოვნების შესაფასებლად გამოყენებული იქნა ტუკის დისპერსიის შემდგომი კორექტირებული ანალიზი.
ჩვენ გამოვიკვლიეთ ცილის დიფერენციალური გამოხატულება ამ საკონტროლო და AD-ის მსგავს AsymAD შემთხვევებს შორის (სურათი 6D და ცხრილი S2L). შედეგად მიღებული ვულკანის რუკა აჩვენებს, რომ 14 პანელის მარკერი მნიშვნელოვნად შეიცვალა ორ ჯგუფს შორის. ამ მარკერების უმეტესობა სინაფსის და მეტაბოლომის წევრია. თუმცა, SOD1 და მირისტოილირებული ალანინით მდიდარი პროტეინ-კინაზა C სუბსტრატი (MARCKS), რომლებიც მიელინის და გლიალური იმუნური ჯგუფების წევრები არიან, შესაბამისად, ასევე მიეკუთვნებიან ამ ჯგუფს (სურათი 6, D და E). სისხლძარღვთა პანელმა ასევე შეიტანა ორი მარკერი, რომლებიც მნიშვნელოვნად შემცირდა AD-ის მსგავს AsymAD ჯგუფში, მათ შორის AE დამაკავშირებელი პროტეინი 1 (AEBP1) და კომპლემენტის ოჯახის წევრი C9. არ იყო მნიშვნელოვანი განსხვავება საკონტროლო და AD-ის მსგავს AsymAD ქვეჯგუფებს შორის ELISA AB1-42 (P = 0.38) და p-tau (P = 0.28), მაგრამ მართლაც იყო მნიშვნელოვანი განსხვავება საერთო ტაუს დონეზე (P = 0.0031). ) (სურ. S7). არსებობს რამდენიმე პანელის მარკერი, რომელიც მიუთითებს იმაზე, რომ ცვლილებები AsymAD ორ ქვეჯგუფს შორის უფრო მნიშვნელოვანია, ვიდრე მთლიანი ტაუს დონეები (მაგალითად, YWHAZ, SOD1 და MDH1) (სურათი 6E). საერთო ჯამში, ეს შედეგები მიუთითებს, რომ ჩვენი დადასტურებული პანელი შეიძლება შეიცავდეს ბიომარკერებს, რომლებსაც შეუძლიათ ასიმპტომური დაავადების მქონე პაციენტების ქვეტიპი და პოტენციური რისკის სტრატიფიკაცია.
გადაუდებელი აუცილებლობაა სისტემაზე დაფუძნებული ბიომარკერების ინსტრუმენტები, რათა უკეთ გავზომოთ და მივმართოთ სხვადასხვა პათოფიზიოლოგიას AD-ს უკან. მოსალოდნელია, რომ ეს ხელსაწყოები არა მხოლოდ შეცვლიან ჩვენს AD დიაგნოსტიკურ ჩარჩოს, არამედ ხელს შეუწყობს ეფექტური, პაციენტისთვის სპეციფიკური მკურნალობის სტრატეგიების მიღებას (1, 2). ამ მიზნით, ჩვენ გამოვიყენეთ მიუკერძოებელი ყოვლისმომცველი პროტეომიკის მიდგომა AD ტვინში და CSF-ზე, რათა განვსაზღვროთ ვებ-ზე დაფუძნებული CSF ბიომარკერები, რომლებიც ასახავს ტვინზე დაფუძნებული პათოფიზიოლოგიის ფართო სპექტრს. ჩვენმა ანალიზმა წარმოქმნა CSF-ის ხუთი ბიომარკერის პანელი, რომელიც (i) ასახავს სინაფსებს, სისხლძარღვებს, მიელინს, იმუნურ და მეტაბოლურ დისფუნქციას; (ii) აჩვენოს ძლიერი განმეორებადობა სხვადასხვა MS პლატფორმაზე; (iii) აჩვენეთ პროგრესირებადი დაავადების სპეციფიკური ცვლილებები AD-ის ადრეულ და გვიან სტადიებზე. მთლიანობაში, ეს დასკვნები წარმოადგენს პერსპექტიულ ნაბიჯს AD კვლევისა და კლინიკური აპლიკაციებისთვის მრავალფეროვანი, საიმედო, ვებ-ზე ორიენტირებული ბიომარკერების ინსტრუმენტების განვითარებისკენ.
ჩვენი შედეგები აჩვენებს AD ტვინის ქსელის პროტეომის მაღალ კონსერვაციას და მხარს უჭერს მის გამოყენებას, როგორც წამყვანს სისტემაზე დაფუძნებული ბიომარკერების განვითარებისთვის. ჩვენი ანალიზი გვიჩვენებს, რომ ორი დამოუკიდებელი TMT-MS მონაცემთა ნაკრები, რომელიც შეიცავს AD და AsymAD ტვინს, აქვს ძლიერი მოდულარულობა. ეს დასკვნები ავრცელებს ჩვენს წინა ნაშრომს, აჩვენებს 2000-ზე მეტი ტვინის ქსოვილის მძლავრი მოდულის შენარჩუნებას მრავალი დამოუკიდებელი კოჰორტისგან შუბლის, პარიეტალური და დროებითი ქერქის ქერქში (17). ეს კონსენსუსის ქსელი ასახავს დაავადებასთან დაკავშირებულ სხვადასხვა ცვლილებებს, რომლებიც დაფიქსირდა მიმდინარე კვლევებში, მათ შორის გლიით მდიდარი ანთებითი მოდულების ზრდა და ნეირონებით მდიდარი მოდულების შემცირება. ამჟამინდელი კვლევის მსგავსად, ამ ფართომასშტაბიან ქსელს ასევე აქვს მნიშვნელოვანი მოდულური ცვლილებები AsymAD-ში, რაც აჩვენებს სხვადასხვა პრეკლინიკურ პათოფიზიოლოგიას (17).
თუმცა, ამ უაღრესად კონსერვატიულ სისტემაზე დაფუძნებულ ჩარჩოში, უფრო წვრილმარცვლოვანი ბიოლოგიური ჰეტეროგენულობაა, განსაკუთრებით AD-ის ადრეულ სტადიაზე მყოფ პირებს შორის. ჩვენს ბიომარკერის პანელს შეუძლია ასახოს ორი ქვეჯგუფი AsymAD-ში, რომლებიც აჩვენებენ მრავალჯერადი CSF მარკერების მნიშვნელოვან დიფერენციალურ გამოხატულებას. ჩვენმა ჯგუფმა შეძლო ხაზგასმით აღენიშნა ბიოლოგიური განსხვავებები ამ ორ ქვეჯგუფს შორის, რომლებიც არ იყო აშკარა AD-ის ძირითადი ბიომარკერების დონეზე. საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით, ამ AsymAD ინდივიდების Aβ1-42/სულ ტაუ თანაფარდობა იყო არანორმალურად დაბალი. თუმცა, მხოლოდ ტაუს მთლიანი დონეები მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდა ორ AsymAD ქვეჯგუფს შორის, ხოლო Aβ1-42 და p-tau დონეები რჩებოდა შედარებით შესადარებელი. ვინაიდან მაღალი CSF ტაუ, როგორც ჩანს, არის კოგნიტური სიმპტომების უკეთესი პროგნოზირება, ვიდრე Aβ1-42 დონეები (7), ჩვენ ეჭვი გვაქვს, რომ AsymAD-ის ორ კოჰორტას შეიძლება ჰქონდეს დაავადების პროგრესირების განსხვავებული რისკი. ჩვენი AsymAD-ის შერჩევის შეზღუდული ზომისა და გრძივი მონაცემების ნაკლებობის გათვალისწინებით, საჭიროა შემდგომი კვლევა ამ დასკვნების დამაჯერებლად გამოსატანად. თუმცა, ეს შედეგები მიუთითებს, რომ სისტემაზე დაფუძნებულ CSF პანელს შეუძლია გააძლიეროს ჩვენი უნარი, ეფექტურად განვასხვავოთ ინდივიდები დაავადების უსიმპტომო სტადიაზე.
საერთო ჯამში, ჩვენი დასკვნები მხარს უჭერს მრავალი ბიოლოგიური ფუნქციის როლს AD-ის პათოგენეზში. თუმცა, ენერგეტიკული მეტაბოლიზმის დარღვევა გახდა ჩვენი ხუთივე დადასტურებული ეტიკეტირების პანელის მთავარი თემა. მეტაბოლური პროტეინები, როგორიცაა ჰიპოქსანტინ-გუანინ ფოსფორიბოზილტრანსფერაზა 1 (HPRT1) და ლაქტატდეჰიდროგენაზა A (LDHA), არის ყველაზე მყარად დადასტურებული სინაფსური ბიომარკერები, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ AD CSF-ის ზრდა არის ძალიან რეპროდუცირებადი სქესი. ჩვენი სისხლძარღვები და გლიური პანელები ასევე შეიცავს რამდენიმე მარკერს, რომლებიც მონაწილეობენ ჟანგვითი ნივთიერებების მეტაბოლიზმში. ეს დასკვნები შეესაბამება ძირითად როლს, რომელსაც მეტაბოლური პროცესები თამაშობენ მთელ ტვინში, არა მხოლოდ ნეირონების მაღალი ენერგიის მოთხოვნილების დასაკმაყოფილებლად, არამედ ასტროციტების და სხვა გლიური უჯრედების მაღალი ენერგიის მოთხოვნილების დასაკმაყოფილებლად (17, 48). ჩვენი შედეგები მხარს უჭერს მზარდ მტკიცებულებას, რომ რედოქს პოტენციალის ცვლილებები და ენერგეტიკული გზების შეწყვეტა შეიძლება იყოს ძირითადი კავშირი AD-ს პათოგენეზში ჩართულ რამდენიმე საკვანძო პროცესს შორის, მათ შორის მიტოქონდრიული დარღვევები, გლიური შუამავლობით გამოწვეული ანთება და სისხლძარღვთა დაზიანება (49). გარდა ამისა, მეტაბოლური ცერებროსპინალური სითხის ბიომარკერები შეიცავს დიდი რაოდენობით დიფერენციალურად მდიდარ პროტეინს ჩვენს საკონტროლო და AD-ის მსგავს AsymAD ქვეჯგუფებს შორის, რაც ვარაუდობს, რომ ამ ენერგიისა და რედოქსის გზების დარღვევა შეიძლება იყოს კრიტიკული დაავადების პრეკლინიკურ სტადიაში.
ტვინისა და ცერებროსპინალური სითხის პანელის განსხვავებულ ტენდენციებს, რომლებიც ჩვენ დავაკვირდით, ასევე საინტერესო ბიოლოგიურ გავლენას ახდენს. ნეირონებით მდიდარი სინაფსები და მეტაბოლიმები აჩვენებენ AD ტვინში დონის შემცირებას და ცერებროსპინალურ სითხეში სიმრავლის გაზრდას. იმის გათვალისწინებით, რომ ნეირონები მდიდარია ენერგიის წარმომქმნელი მიტოქონდრიებით სინაფსებში, რათა უზრუნველყონ ენერგია მათი მრავალი სპეციალიზებული სიგნალისთვის (50), მოსალოდნელია ამ ორი ნეირონის ჯგუფის გამოხატვის პროფილების მსგავსება. ნეირონების დაკარგვამ და დაზიანებული უჯრედების ექსტრუზიამ შეიძლება ახსნას ტვინის და CSF პანელის ტენდენციები მოგვიანებით დაავადებაში, მაგრამ მათ არ შეუძლიათ ახსნან ადრეული პანელის ცვლილებები, რომლებსაც ჩვენ ვხედავთ (13). ამ აღმოჩენების ერთ-ერთი შესაძლო ახსნა ადრეულ ასიმპტომურ დაავადებაში არის პათოლოგიური სინაფსური მორთვა. თაგვის მოდელებში ახალი მტკიცებულება ვარაუდობს, რომ მიკროგლიის შუამავლობით გამოწვეული სინაფსური ფაგოციტოზი შესაძლოა არანორმალურად გააქტიურდეს AD-ში და გამოიწვიოს ტვინში სინაფსების ადრეული დაკარგვა (51). ეს გადაგდებული სინაფსური მასალა შეიძლება დაგროვდეს CSF-ში, რის გამოც ჩვენ ვაკვირდებით CSF-ის ზრდას ნეირონულ პანელში. იმუნური შუამავლობით სინაფსური გასხვლა ასევე შეიძლება ნაწილობრივ აიხსნას გლიური ცილების მატება, რომელსაც ვაკვირდებით ტვინში და ცერებროსპინალურ სითხეში დაავადების მთელი პროცესის განმავლობაში. სინაფსური გასხვლის გარდა, ეგზოციტური გზის მთლიანმა ანომალიებმა შეიძლება ასევე გამოიწვიოს ნეირონული მარკერების ტვინის და CSF-ის სხვადასხვა გამოხატულება. არაერთმა კვლევამ აჩვენა, რომ AD ტვინის პათოგენეზში ეგზოსომების შემცველობა შეიცვალა (52). უჯრედგარე გზა ასევე მონაწილეობს Aβ-ის პროლიფერაციაში (53, 54). აღსანიშნავია, რომ ეგზოსომური სეკრეციის დათრგუნვამ შეიძლება შეამციროს AD-ის მსგავსი პათოლოგია AD ტრანსგენური თაგვის მოდელებში (55).
ამავდროულად, სისხლძარღვთა პანელში ცილა აჩვენა AD ტვინის ზომიერი ზრდა, მაგრამ მნიშვნელოვნად შემცირდა CSF-ში. ჰემატოენცეფალური ბარიერის (BBB) ​​დისფუნქციას შეუძლია ნაწილობრივ ახსნას ეს დასკვნები. მრავალმა დამოუკიდებელმა მშობიარობის შემდგომმა კვლევამ აჩვენა BBB დაშლა AD-ში (56, 57). ამ კვლევებმა დაადასტურა სხვადასხვა არანორმალური აქტივობა ენდოთელური უჯრედების ამ მჭიდროდ დალუქული ფენის გარშემო, მათ შორის ტვინის კაპილარული გაჟონვა და სისხლით გადამდები ცილების პერივასკულარული დაგროვება (57). ამან შეიძლება მარტივი ახსნა მოგვცეს თავის ტვინში ამაღლებული სისხლძარღვთა ცილების შესახებ, მაგრამ სრულად ვერ ხსნის იმავე ცილების ცერებროსპინალურ სითხეში. ერთ-ერთი შესაძლებლობა ის არის, რომ ცენტრალური ნერვული სისტემა აქტიურად ახდენს ამ მოლეკულების იზოლირებას ანთების და ოქსიდაციური სტრესის გაზრდის პრობლემის გადასაჭრელად. ამ პანელში ზოგიერთი ყველაზე მძიმე CSF პროტეინის შემცირება, განსაკუთრებით ლიპოპროტეინების რეგულირებაში ჩართული, დაკავშირებულია ანთების მავნე დონის დათრგუნვასთან და რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების ნეიროპროტექტორულ პროცესთან. ეს ეხება პაროქსონაზა 1-ს (PON1), ლიპოპროტეინების დამაკავშირებელ ფერმენტს, რომელიც პასუხისმგებელია ცირკულაციაში ოქსიდაციური სტრესის დონის შემცირებაზე (58, 59). ალფა-1-მიკროგლობულინი/ბიკუნინის წინამორბედი (AMBP) არის კიდევ ერთი მნიშვნელოვნად დაქვეითებული სისხლძარღვთა ჯგუფის მარკერი. ეს არის ლიპიდური გადამტანი ბიკუნინის წინამორბედი, რომელიც ასევე მონაწილეობს ანთების ჩახშობაში და ნევროლოგიურ დაცვაში (60, 61).
მიუხედავად სხვადასხვა საინტერესო ჰიპოთეზისა, ბიოქიმიური დაავადების მექანიზმების უშუალოდ გამოვლენის შეუძლებლობა არის აღმოჩენაზე ორიენტირებული პროტეომიკის ანალიზის ცნობილი შეზღუდვა. ამიტომ, შემდგომი კვლევა აუცილებელია ამ ბიომარკერების პანელების უკან არსებული მექანიზმების დამაჯერებლად განსაზღვრისთვის. MS-ზე დაფუძნებული კლინიკური ანალიზის განვითარებაზე გადასასვლელად, მომავალი მიმართულება ასევე მოითხოვს მიზნობრივი რაოდენობრივი მეთოდების გამოყენებას ფართომასშტაბიანი ბიომარკერების გადამოწმებისთვის, როგორიცაა შერჩევითი ან პარალელური რეაქციის მონიტორინგი (62). ჩვენ ცოტა ხნის წინ გამოვიყენეთ პარალელური რეაქციის მონიტორინგი (63) აქ აღწერილი CSF ცილის მრავალი ცვლილების დასადასტურებლად. რამდენიმე პრიორიტეტული პანელის სამიზნე რაოდენობრივია მნიშვნელოვანი სიზუსტით, მათ შორის YWHAZ, ALDOA და SMOC1, რომლებიც ასახავს ჩვენს სინაფსებს, მეტაბოლიზმს და ანთების პანელებს, შესაბამისად (63). მონაცემთა დამოუკიდებელი შეგროვება (DIA) და სხვა MS-ზე დაფუძნებული სტრატეგიები ასევე შეიძლება სასარგებლო იყოს სამიზნე ვერიფიკაციისთვის. ბუდი და სხვ. (64) ახლახან აჩვენეს, რომ არსებობს მნიშვნელოვანი გადახურვა AD ბიომარკერებს შორის, რომლებიც იდენტიფიცირებულია ჩვენს CSF-ის აღმოჩენის მონაცემთა ნაკრებში და დამოუკიდებელ DIA-MS მონაცემთა ნაკრებში, რომელიც შედგება თითქმის 200 CSF ნიმუშისგან სამი სხვადასხვა ევროპული კოჰორტისგან. ეს ბოლო კვლევები მხარს უჭერს ჩვენი პანელების პოტენციალს, გარდაიქმნას საიმედო MS-ზე დაფუძნებულ გამოვლენად. ანტისხეულების და აპტამერზე დაფუძნებული ტრადიციული გამოვლენა ასევე მნიშვნელოვანია AD ძირითადი ბიომარკერების შემდგომი განვითარებისთვის. CSF-ის დაბალი სიმრავლის გამო, უფრო რთულია ამ ბიომარკერების აღმოჩენა მაღალი გამტარუნარიანობის MS მეთოდების გამოყენებით. NEFL და NRGN არის დაბალი სიმრავლის CSF ბიომარკერების ორი ასეთი მაგალითი, რომლებიც ასახულია პანელზე ჩვენს ყოვლისმომცველ ანალიზში, მაგრამ არ შეიძლება საიმედოდ გამოვლენილი იყოს ჩვენი MS სტრატეგიის გამოყენებით. მრავალ ანტისხეულზე დაფუძნებული მიზნობრივი სტრატეგიები, როგორიცაა PEA, შეიძლება ხელი შეუწყოს ამ მარკერების კლინიკურ ტრანსფორმაციას.
მთლიანობაში, ეს კვლევა გთავაზობთ უნიკალურ პროტეომიკურ მიდგომას CSF AD ბიომარკერების იდენტიფიკაციისა და გადამოწმებისთვის სხვადასხვა სისტემებზე დაყრდნობით. ამ მარკერის პანელების ოპტიმიზაცია AD-ის დამატებით კოჰორტებსა და MS პლატფორმებზე შეიძლება დამაიმედებელი აღმოჩნდეს AD რისკის სტრატიფიკაციისა და მკურნალობის წინსვლისთვის. კვლევები, რომლებიც აფასებენ ამ პანელების გრძივი დონეს დროთა განმავლობაში, ასევე მნიშვნელოვანია იმის დასადგენად, თუ რომელი მარკერების კომბინაცია საუკეთესოდ აყალიბებს ადრეული დაავადების რისკს და დაავადების სიმძიმის ცვლილებებს.
CSF-ის მიერ დაკოპირებული 3 ნიმუშის გარდა, ამ კვლევაში გამოყენებული CSF-ის ყველა ნიმუში შეგროვდა Emory ADRC-ის ან მჭიდროდ დაკავშირებული კვლევითი ინსტიტუტების ეგიდით. ემორის CSF-ის ნიმუშების სულ ოთხი კომპლექტი იქნა გამოყენებული პროტეომიკის ამ კვლევებში. აღმოჩნდა, რომ CSF კოჰორტა შეიცავს ნიმუშებს 20 ჯანმრთელი კონტროლისგან და 20 AD პაციენტისგან. CSF ასლი 1 მოიცავს ნიმუშებს 32 ჯანმრთელი კონტროლისგან, 31 AsymAD ინდივიდიდან და 33 AD ინდივიდიდან. CSF ასლი 2 შეიცავს 147 კონტროლს და 150 AD ნიმუშს. მრავალდაავადებით CSF რეპლიკაციის 4 კოჰორტა მოიცავდა 18 საკონტროლო, 17 AD, 19 ALS, 13 PD და 11 FTD ნიმუშს. ემორის უნივერსიტეტის ინსტიტუციური მიმოხილვის საბჭოს მიერ დამტკიცებული შეთანხმების თანახმად, ემორის კვლევის ყველა მონაწილემ მიიღო ინფორმირებული თანხმობა. 2014 წლის ეროვნული ინსტიტუტის დაბერების საუკეთესო პრაქტიკის გაიდლაინებით ალცჰეიმერის ცენტრებისთვის (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) ცერებროსპინალური სითხე შეგროვდა და ინახებოდა წელის პუნქციის საშუალებით. საკონტროლო და AsymAD და AD პაციენტებმა მიიღეს სტანდარტიზებული კოგნიტური შეფასება Emory Cognitive Neurology Clinic-ში ან Goizueta ADRC-ში. მათი ცერებროსპინალური სითხის ნიმუშები შემოწმდა INNO-BIA AlzBio3 Luminex-ის მიერ ELISA Aβ1-42, საერთო tau და p-tau ანალიზისთვის (65). ELISA მნიშვნელობები გამოიყენება სუბიექტების დიაგნოსტიკური კლასიფიკაციის მხარდასაჭერად AD ბიომარკერის შეწყვეტის დადგენილი კრიტერიუმების საფუძველზე (66, 67). ძირითადი დემოგრაფიული და დიაგნოსტიკური მონაცემები CSF-ის სხვა დიაგნოზებისთვის (FTD, ALS და PD) ასევე მიღებულია Emory ADRC-დან ან შვილობილი კვლევითი ინსტიტუტებიდან. შემთხვევის შემაჯამებელი მეტამონაცემები ამ Emory CSF შემთხვევისთვის შეგიძლიათ იხილოთ ცხრილში S1A. შვეიცარიული CSF რეპლიკაციის 3 კოჰორტის მახასიათებლები ადრე იყო გამოქვეყნებული (45).
CSF-მა იპოვა ნიმუში. CSF მონაცემთა ნაკრების ჩვენი აღმოჩენის სიღრმის გაზრდის მიზნით, მაღალი სიმრავლის ცილების იმუნური მოხმარება განხორციელდა ტრიფსინიზაციამდე. მოკლედ, 130 μl CSF 40 ცალკეული CSF ნიმუშიდან და თანაბარი მოცულობა (130 μl) მაღალი შერჩევის ტოპ 14 სიმრავლის პროტეინის დაქვეითების ფისოვანი (Thermo Fisher Scientific, A36372) მოთავსებული იყო ტრიალების სვეტში (Thermo Fisher Scientific, A89868) ოთახში. ტემპერატურის ინკუბაცია). 15 წუთის განმავლობაში დატრიალების შემდეგ, ნიმუშის ცენტრიფუგა 1000 გ-ზე 2 წუთის განმავლობაში. 3K ულტრაცენტრიფუგული ფილტრის მოწყობილობა (Millipore, UFC500396) გამოიყენებოდა ჩამდინარე წყლების ნიმუშის კონცენტრირებისთვის 14,000 გ-ზე ცენტრიფუგირებით 30 წუთის განმავლობაში. ნიმუშის ყველა მოცულობის განზავება 75 μl-მდე ფოსფატის ბუფერული მარილით. ცილის კონცენტრაცია შეფასდა ბიკინქონინის მჟავას (BCA) მეთოდით მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით (Thermo Fisher Scientific). იმუნოდეფიციტური CSF (60 μl) 40-ვე ნიმუშიდან დაიჯესტირდა ლიზილ ენდოპეპტიდაზათ (LysC) და ტრიპსინთან ერთად. მოკლედ, ნიმუში შემცირდა და ალკილირდა 1.2 მკლ 0.5 M ტრის-2(-კარბოქსიეთილ)-ფოსფინით და 3 მკლ 0.8 მ ქლოროაცეტამიდით 90°C-ზე 10 წუთის განმავლობაში და შემდეგ სონიკირებულ იქნა წყლის აბაზანაში 15 წუთის განმავლობაში. ნიმუში განზავებულია 193 μl 8 M შარდოვანას ბუფერით [8 M შარდოვანა და 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] 6 M შარდოვანას საბოლოო კონცენტრაციამდე. LysC (4,5 μg; Wako) გამოიყენება ღამის მონელებისთვის ოთახის ტემპერატურაზე. ნიმუში შემდეგ განზავებულია 1 M შარდოვანამდე 50 მმ ამონიუმის ბიკარბონატით (ABC) (68). დაამატეთ თანაბარი რაოდენობით (4,5 მკგ) ტრიპსინი (პრომეგა) და შემდეგ გააჩერეთ ნიმუში 12 საათის განმავლობაში. მონელებული პეპტიდის ხსნარის მჟავიანობა 1% ჭიანჭველა მჟავისა (FA) და 0.1% ტრიფტორძმარმჟავას (TFA) (66) საბოლოო კონცენტრაციამდე და შემდეგ 50 მგ Sep-Pak C18 სვეტით (წყლები), როგორც აღწერილია ზემოთ (25) . შემდეგ პეპტიდი გამოირეცხა 1 მლ 50% აცეტონიტრილში (ACN). პროტეინის რაოდენობრივი განსაზღვრის სტანდარტიზებისთვის პარტიებში (25), 100 μl ალიკვოტები 40 CSF-ის ნიმუშიდან გაერთიანდა შერეული ნიმუშის შესაქმნელად, რომელიც შემდეგ დაიყო ხუთ გლობალური შიდა სტანდარტის (GIS) (48) ნიმუშად. ყველა ინდივიდუალური ნიმუში და კომბინირებული სტანდარტები შრება მაღალსიჩქარიანი ვაკუუმით (Labconco).
CSF აკოპირებს ნიმუშს. დეიონმა და კოლეგებმა ადრე აღწერეს CSF-ის ასლის 3 ნიმუშის იმუნური დაქვეითება და მონელება (45, 46). დარჩენილი ნიმუშები არ იყო იმუნოდეფიციტური ინდივიდუალურად. დაიჯეტე ეს ამოღებული ნიმუშები ტრიპსინში, როგორც ზემოთ იყო აღწერილი (17). ყოველი განმეორებითი ანალიზისთვის, გამორეცხილი პეპტიდის 120 მკლ ალიკვოტი თითოეული ნიმუშიდან იყო გაერთიანებული და დაყოფილი თანაბარ მოცულობის ალიკვოტებად, რათა გამოიყენონ, როგორც TMT-ით ეტიკეტირებული გლობალური შიდა სტანდარტი (48). ყველა ინდივიდუალური ნიმუში და კომბინირებული სტანდარტები შრება მაღალსიჩქარიანი ვაკუუმით (Labconco). დაბალი სიმრავლის CSF ცილის სიგნალის გასაძლიერებლად, თითოეული ნიმუშიდან 125 μl კომბინირებით, მომზადდა „გაძლიერებული“ ნიმუში თითოეული რეპლიკაციული ანალიზისთვის [ანუ ბიოლოგიური ნიმუში, რომელიც იმიტირებს კვლევის ნიმუშს, მაგრამ ხელმისაწვდომი რაოდენობა არის ბევრად უფრო დიდი (37, 69)] გაერთიანდა CSF შერეულ ნიმუშში (17). შერეული ნიმუში შემდეგ იმუნური ამოღებულია 12 მლ მაღალი შერჩევით Top14 სიმრავლის პროტეინის მოსაცილებელი ფისის გამოყენებით (Thermo Fisher Scientific, A36372), დაიჯესტირდება, როგორც ზემოთ აღწერილია და შედის შემდგომ მრავალჯერადი TMT მარკირებაში.