გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს შეზღუდული CSS მხარდაჭერა. საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). იმავდროულად, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ გამოვიყვანთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
თერმოფილები არის მიკროორგანიზმები, რომლებიც ხარობენ მაღალ ტემპერატურაზე. მათ შესწავლას შეუძლია მოგვცეს ღირებული ინფორმაცია იმის შესახებ, თუ როგორ ერგება ცხოვრება ექსტრემალურ პირობებს. თუმცა, რთულია მაღალი ტემპერატურის პირობების მიღწევა ჩვეულებრივი ოპტიკური მიკროსკოპით. შემოთავაზებულია რამდენიმე საშინაო გადაწყვეტა, რომელიც დაფუძნებულია ადგილობრივ რეზისტენტულ ელექტრო გათბობაზე, მაგრამ არ არსებობს მარტივი კომერციული გადაწყვეტა. ამ ნაშრომში, ჩვენ წარმოგიდგენთ მიკროსკოპული ლაზერული გათბობის კონცეფციას მიკროსკოპის ხედვის ველზე, რათა უზრუნველყოს მაღალი ტემპერატურა თერმოფილური კვლევებისთვის, ხოლო მომხმარებლის გარემო რბილი იყოს. ზომიერი ლაზერის ინტენსივობის მიკრომასშტაბიანი გათბობა შეიძლება მიღწეული იქნას ოქროს ნანონაწილაკებით დაფარული სუბსტრატის გამოყენებით, როგორც ბიოთავსებადი და ეფექტური სინათლის შთამნთქმელი. განხილულია მიკრომასშტაბიანი სითხის კონვექციის, უჯრედების შეკავების და ცენტრიდანული თერმოფორეზული მოძრაობის შესაძლო ეფექტები. მეთოდი ნაჩვენებია ორ სახეობაში: (i) Geobacillus stearothermophilus, აქტიური თერმოფილური ბაქტერია, რომელიც მრავლდება დაახლოებით 65°C ტემპერატურაზე, რომელიც ჩვენ დავაკვირდით, რომ აღმოცენდება, იზრდება და ცურავს მიკრომასშტაბიანი გათბობის ქვეშ; (ii) Thiobacillus sp., ოპტიმალურად ჰიპერთერმოფილური არქეა. 80°C-ზე. ეს ნამუშევარი უხსნის გზას თერმოფილურ მიკროორგანიზმებზე მარტივი და უსაფრთხო დაკვირვებისთვის თანამედროვე და ხელმისაწვდომი მიკროსკოპული ხელსაწყოების გამოყენებით.
მილიარდობით წლის განმავლობაში დედამიწაზე სიცოცხლე განვითარდა, რათა მოერგოს გარემო პირობების ფართო სპექტრს, რომლებიც ზოგჯერ უკიდურესად ითვლება ჩვენი ადამიანური პერსპექტივიდან. კერძოდ, ზოგიერთი თერმოფილური მიკროორგანიზმი (ბაქტერიები, არქეა, სოკოები), სახელწოდებით თერმოფილები, ხარობს ტემპერატურულ დიაპაზონში 45°C-დან 122°C-მდე1, 2, 3, 4. თერმოფილები ცხოვრობენ სხვადასხვა ეკოსისტემებში, როგორიცაა ღრმა ზღვის ჰიდროთერმული ხვრელები, ცხელი წყაროები. ან ვულკანური უბნები. მათმა კვლევამ დიდი ინტერესი გამოიწვია ბოლო რამდენიმე ათწლეულის განმავლობაში სულ მცირე ორი მიზეზის გამო. პირველ რიგში, მათგან შეგვიძლია ვისწავლოთ, მაგალითად, როგორ სტაბილურია თერმოფილები 5, 6, ფერმენტები 7, 8 და მემბრანა 9 ასეთ მაღალ ტემპერატურაზე, ან როგორ უძლებენ თერმოფილები რადიაციის უკიდურეს დონეს10. მეორე, ისინი მრავალი მნიშვნელოვანი ბიოტექნოლოგიური გამოყენების საფუძველია1,11,12, როგორიცაა საწვავის წარმოება13,14,15,16, ქიმიური სინთეზი (დიჰიდრო, ალკოჰოლი, მეთანი, ამინომჟავები და ა. 13. კერძოდ, ამჟამად კარგად ცნობილი პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR)19 მოიცავს ფერმენტს (Taq პოლიმერაზა), რომელიც იზოლირებულია თერმოფილური ბაქტერიისგან Thermus aquaticus, ერთ-ერთი პირველი აღმოჩენილი თერმოფილი.
თუმცა, თერმოფილების შესწავლა იოლი საქმე არ არის და ვერცერთ ბიოლოგიურ ლაბორატორიაში ვერ მოხერხდება. კერძოდ, ცოცხალი თერმოფილების დაკვირვება შეუძლებელია in vitro ნებისმიერი სტანდარტული სინათლის მიკროსკოპით, თუნდაც კომერციულად ხელმისაწვდომი გამათბობელი კამერებით, რომლებიც ჩვეულებრივ შეფასებულია 40°C-მდე დაბალ ტემპერატურაზე. 1990-იანი წლებიდან მხოლოდ რამდენიმე კვლევითმა ჯგუფმა მიუძღვნა თავი მაღალი ტემპერატურის მიკროსკოპის (HTM) სისტემების დანერგვას. 1994 წელს გლუხი და სხვ. გათბობა/გაგრილების კამერა შეიქმნა პელტიეს უჯრედის გამოყენების საფუძველზე, რომელიც აკონტროლებს დახურულ ოთხკუთხა კაპილარების ტემპერატურას ანაერობულობის შესანარჩუნებლად 20 . მოწყობილობის გაცხელება შესაძლებელია 100 °C-მდე 2 °C/წმ სიჩქარით, რაც ავტორებს საშუალებას აძლევს შეისწავლონ ჰიპერთერმოფილური ბაქტერიის Thermotoga maritima21 მოძრაობა. 1999 წელს ჰორნი და სხვ. შემუშავებულია ძალიან მსგავსი მოწყობილობა, რომელიც ჯერ კიდევ ეფუძნება გაცხელებული კაპილარების გამოყენებას, რომელიც შესაფერისია კომერციული მიკროსკოპისთვის უჯრედების გაყოფის/დაკავშირების შესასწავლად. შედარებითი უმოქმედობის ხანგრძლივი პერიოდის შემდეგ, ეფექტური HTM-ების ძებნა განახლდა 2012 წელს, განსაკუთრებით Wirth ჯგუფის ნაშრომების სერიასთან დაკავშირებით, რომელიც გამოიყენებდა ჰორნის და სხვების მიერ გამოგონილ მოწყობილობას. თხუთმეტი წლის წინ, დიდი რაოდენობით არქეების მოძრაობა, მათ შორის ჰიპერთერმოფილები, შეისწავლეს 100°C-მდე ტემპერატურაზე გახურებული კაპილარების გამოყენებით23,24. მათ ასევე შეცვალეს ორიგინალური მიკროსკოპი, რათა მიაღწიონ უფრო სწრაფ გათბობას (რამდენიმე წუთი 35 წუთის ნაცვლად, რომ მიაღწიონ დადგენილ ტემპერატურას) და მიაღწიონ ხაზოვანი ტემპერატურის გრადიენტს 2 სმ-ზე მეტი საშუალოზე. ეს ტემპერატურული გრადიენტის ფორმირების მოწყობილობა (TGFD) გამოიყენებოდა მრავალი თერმოფილის მობილობის შესასწავლად ტემპერატურის გრადიენტებში ბიოლოგიურად შესაბამის დისტანციებზე 24, 25.
დახურული კაპილარების გათბობა არ არის ერთადერთი გზა ცოცხალი თერმოფილების დასაკვირვებლად. 2012 წელს კუვაბარა და სხვ. გამოყენებული იქნა ხელნაკეთი ერთჯერადი Pyrex კამერები, დალუქული სითბოს მდგრადი წებოთი (Super X2; Cemedine, იაპონია). ნიმუშები მოთავსდა კომერციულად ხელმისაწვდომ გამჭვირვალე გამათბობელ ფირფიტაზე (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, იაპონია), რომელსაც შეუძლია გაცხელება 110°C-მდე, მაგრამ თავდაპირველად არ იყო განკუთვნილი ბიოგამოსახულებისთვის. ავტორებმა დააფიქსირეს ანაერობული თერმოფილური ბაქტერიების (Thermosipho globiformans, გაორმაგების დრო 24 წთ) ეფექტური გაყოფა 65°C ტემპერატურაზე. 2020 წელს პულშენი და სხვ. კომერციული ლითონის ჭურჭლის (AttofluorTM, Thermofisher) ეფექტური გათბობა დემონსტრირებულ იქნა ორი თვითნაკეთი გამათბობელი ელემენტის გამოყენებით: სახურავი და ეტაპი (PCR მანქანით შთაგონებული კონფიგურაცია). ეს კავშირი იწვევს სითხის ერთგვაროვან ტემპერატურას და ხელს უშლის აორთქლებას და კონდენსაციას სახურავის ბოლოში. O-ring-ის გამოყენება ხელს უშლის გაზის გაცვლას გარემოსთან. ეს HTM, სახელად სულფოსკოპი, გამოიყენებოდა Sulfolobus acidocaldarius-ის გამოსახულების მიზნით 75°C27 ტემპერატურაზე.
ყველა ამ სისტემის აღიარებული შეზღუდვა იყო ჰაერის მიზნების გამოყენების შეზღუდვა, ზეთის ნებისმიერი ჩაძირვა შეუფერებელია ასეთი მაღალი ტემპერატურისთვის და >1 მმ სისქის გამჭვირვალე ნიმუშების გამოსახულების მისაღებად. ყველა ამ სისტემის აღიარებული შეზღუდვა იყო ჰაერის მიზნების გამოყენების შეზღუდვა, ზეთის ნებისმიერი ჩაძირვა შეუფერებელია ასეთი მაღალი ტემპერატურისთვის და >1 მმ სისქის გამჭვირვალე ნიმუშების გამოსახულების მისაღებად. შეზღუდვები ყველა სისტემის შეზღუდვის შესახებ 1 მმ. ყველა ამ სისტემის აღიარებული ნაკლოვანება იყო ჰაერის მიზნების გამოყენების შეზღუდვა, რადგან ზეთის ნებისმიერი ჩაძირვა არ იყო შესაფერისი ასეთი მაღალი ტემპერატურისთვის და 1 მმ სისქის გამჭვირვალე ნიმუშების ვიზუალიზაციისთვის.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合迁毫米厚的透明样品成像. ყველა ამ სისტემის აღიარებული შეზღუდვა არის ჰაერგამტარი სარკის გამოყენების შეზღუდვა, რადგან ზეთის ნებისმიერი ჩაძირვა შეუსაბამოა გამჭვირვალე ნიმუშების გამოსახულების მისაღებად > 1 მმ სისქის ასეთ მაღალ ტემპერატურაზე. ყველა ეს სისტემა შეუზღუდავია. ყველა ამ სისტემის აღიარებული ნაკლი არის ჰაერის ლინზების შეზღუდული გამოყენება, ნებისმიერი ზეთის ჩაძირვა შეუფერებელია ასეთი მაღალი ტემპერატურისთვის და ვიზუალიზაციისთვის გამჭვირვალე ნიმუშების სისქის >1 მმ-ზე.ცოტა ხნის წინ, ეს შეზღუდვა გააუქმა ჩარლზ-ორზაგმა და სხვებმა. 28, რომელმაც შეიმუშავა მოწყობილობა, რომელიც აღარ უზრუნველყოფს სითბოს ინტერესის სისტემის ირგვლივ, არამედ თავად საფარი შუშის შიგნით, დაფარული ITO-სგან დამზადებული რეზისტორის თხელი გამჭვირვალე ფენით (ინდიუმ-კალის ოქსიდი). სახურავი შეიძლება გაცხელდეს 75 °C-მდე გამჭვირვალე ფენაში ელექტრო დენის გავლის გზით. თუმცა, ავტორმა ასევე უნდა გაათბოს ობიექტივი ობიექტამდე, მაგრამ არაუმეტეს 65 °C, რათა არ დაზიანდეს.
ეს სამუშაოები აჩვენებს, რომ ეფექტური მაღალი ტემპერატურის ოპტიკური მიკროსკოპის შემუშავება ფართოდ არ არის მიღებული, ხშირად საჭიროებს ხელნაკეთ აღჭურვილობას და ხშირად მიიღწევა სივრცითი გარჩევადობის ფასად, რაც სერიოზული მინუსია იმის გათვალისწინებით, რომ თერმოფილური მიკროორგანიზმები არ აღემატება რამდენიმეს. მიკრომეტრები. შემცირებული გათბობის მოცულობა არის HTM-ის სამი თანდაყოლილი პრობლემის გადაჭრის გასაღები: ცუდი სივრცითი გარჩევადობა, მაღალი თერმული ინერცია, როდესაც სისტემა თბება და მიმდებარე ელემენტების მავნე გათბობა (იმერსიული ზეთი, ობიექტივი… ან მომხმარებლის ხელები) ექსტრემალურ ტემპერატურაზე. ).
ამ ნაშრომში წარმოგიდგენთ HTM თერმოფილების დაკვირვებისთვის, რომელიც არ არის დაფუძნებული რეზისტენტულ გათბობაზე. ამის ნაცვლად, ჩვენ მივაღწიეთ ლოკალიზებულ გათბობას მიკროსკოპის ხედვის ველის შეზღუდულ რეგიონში სინათლის შთამნთქმელი სუბსტრატის ლაზერული დასხივებით. ტემპერატურის განაწილება ვიზუალური იყო რაოდენობრივი ფაზის მიკროსკოპის (QPM) გამოყენებით. ამ მეთოდის ეფექტურობას ადასტურებს Geobacillus stearothermophilus, მოძრავი თერმოფილური ბაქტერია, რომელიც მრავლდება დაახლოებით 65°C-ზე და აქვს გაორმაგების მოკლე დრო (დაახლოებით 20 წუთი) და Sulfolobus shibatae, ჰიპერთერმოფილი, რომელიც ოპტიმალურად იზრდება 80°C-ზე (archae). საილუსტრაციოდ. ნორმალური რეპლიკაციის სიჩქარე და ცურვა დაფიქსირდა ტემპერატურის ფუნქციის მიხედვით. ეს ლაზერული HTM (LA-HTM) არ შემოიფარგლება საფარის სისქით ან ობიექტის ბუნებით (ჰაერი ან ზეთის ჩაძირვა). ეს საშუალებას გაძლევთ გამოიყენოთ ბაზარზე არსებული ნებისმიერი მაღალი გარჩევადობის ობიექტივი. ის ასევე არ განიცდის ნელ გათბობას თერმული ინერციის გამო (აღწევს მყისიერ გათბობას მილიწამის მასშტაბით) და იყენებს მხოლოდ კომერციულად ხელმისაწვდომ კომპონენტებს. უსაფრთხოების ერთადერთი ახალი შეშფოთება დაკავშირებულია მძლავრი ლაზერული სხივების არსებობასთან (როგორც წესი, 100 მვტ-მდე) მოწყობილობის შიგნით და შესაძლოა თვალების მეშვეობით, რაც მოითხოვს დამცავ სათვალეებს.
LA-HTM-ის პრინციპია ლაზერის გამოყენება ნიმუშის ლოკალურად გასათბობად მიკროსკოპის ხედვის ველში (ნახ. 1a). ამისათვის ნიმუში უნდა იყოს სინათლის შთამნთქმელი. გონივრული ლაზერული სიმძლავრის გამოსაყენებლად (100 მვტ-ზე ნაკლები), ჩვენ არ დავეყრდნოთ თხევადი გარემოს მიერ სინათლის შთანთქმას, მაგრამ ხელოვნურად გავზარდეთ ნიმუშის შთანთქმა სუბსტრატის ოქროს ნანონაწილაკებით დაფარვით (ნახ. 1c). ოქროს ნანონაწილაკების სინათლით გაცხელება ფუნდამენტური მნიშვნელობისაა თერმული პლაზმონიკის სფეროში, მოსალოდნელი აპლიკაციებით ბიომედიცინაში, ნანოქიმიაში ან მზის სხივების შეგროვებაში29,30,31. ბოლო რამდენიმე წლის განმავლობაში, ჩვენ გამოვიყენეთ ეს LA-HTM რამდენიმე კვლევაში, რომლებიც დაკავშირებულია თერმული პლაზმის გამოყენებასთან ფიზიკაში, ქიმიასა და ბიოლოგიაში. ამ მეთოდის მთავარი სირთულე არის საბოლოო ტემპერატურული პროფილის ჩვენება, ვინაიდან ამაღლებული ტემპერატურა შემოიფარგლება ნიმუშში არსებული მიკრომასშტაბიანი რეგიონით. ჩვენ ვაჩვენეთ, რომ ტემპერატურის რუკების მიღწევა შესაძლებელია ოთხი ტალღის სიგრძის განივი ათვლის ინტერფერომეტრით, რაოდენობრივი ფაზის მიკროსკოპის მარტივი, მაღალი გარჩევადობის და ძალიან მგრძნობიარე მეთოდით, რომელიც ეფუძნება ორგანზომილებიანი დიფრაქციული ბადეების გამოყენებას (ასევე ცნობილია როგორც ჯვარედინი ბადეები). 33,34,35,36. ამ თერმული მიკროსკოპის ტექნიკის სანდოობა, რომელიც დაფუძნებულია გადაკვეთის ტალღის ფრონტის მიკროსკოპის (CGM) საფუძველზე, ნაჩვენებია ბოლო ათწლეულის განმავლობაში გამოქვეყნებულ ათეულ ნაშრომში37,38,39,40,41,42,43.
პარალელური ლაზერული გათბობის, ფორმის და ტემპერატურის მიკროსკოპის დაყენების სქემა. b ნიმუშის გეომეტრია, რომელიც შედგება AttofluorTM კამერისგან, რომელიც შეიცავს ოქროს ნანონაწილაკებით დაფარულ საფარს. c ყურადღებით დააკვირდით ნიმუშს (არა მასშტაბის). d წარმოადგენს ლაზერის სხივის ერთგვაროვან პროფილს და (e) სიმულაციური შემდგომი ტემპერატურის განაწილებას ოქროს ნანონაწილაკების ნიმუშის სიბრტყეზე. f არის რგოლოვანი ლაზერული სხივის პროფილი, რომელიც შესაფერისია ერთიანი ტემპერატურის შესაქმნელად, როგორც ნაჩვენებია შედეგად მიღებული ტემპერატურის განაწილების სიმულაციაში, რომელიც ნაჩვენებია (g). მასშტაბის ზოლი: 30 μm.
კერძოდ, ჩვენ ახლახან მივაღწიეთ ძუძუმწოვრების უჯრედების გათბობას LA-HTM და CGM-ით და ვაკვირდებოდით უჯრედულ სითბურ შოკს 37-42°C დიაპაზონში, რაც აჩვენა ამ ტექნიკის გამოყენებადობა ერთი ცოცხალი უჯრედის გამოსახულებაზე. თუმცა, LA-HTM-ის გამოყენება მიკროორგანიზმების შესასწავლად მაღალ ტემპერატურაზე არ არის ცალსახა, რადგან ის მეტ სიფრთხილეს მოითხოვს ძუძუმწოვართა უჯრედებთან შედარებით: პირველ რიგში, გარემოს ფსკერის გაცხელება ათობით გრადუსით (და არა რამდენიმე გრადუსით) იწვევს. ძლიერ ვერტიკალურ ტემპერატურულ გრადიენტამდე. შეუძლია შექმნას სითხის კონვექცია 44, რომელიც, თუ მყარად არ არის მიმაგრებული სუბსტრატზე, შეიძლება გამოიწვიოს ბაქტერიების არასასურველი მოძრაობა და შერევა. ეს კონვექცია შეიძლება აღმოიფხვრას თხევადი ფენის სისქის შემცირებით. ამ მიზნით, ქვემოთ წარმოდგენილ ყველა ექსპერიმენტში, ბაქტერიული სუსპენზია მოთავსებული იყო ორ საფარს შორის, დაახლოებით 15 მკმ სისქით, მოთავსებულ ლითონის თასში (AttofluorTM, Thermofisher, სურ. 1b,c). პრინციპში, კონვექციის თავიდან აცილება შესაძლებელია, თუ სითხის სისქე უფრო მცირეა, ვიდრე გათბობის ლაზერის სხივის ზომა. მეორეც, ასეთ შეზღუდულ გეომეტრიაში მუშაობამ შეიძლება დაახშოს აერობული ორგანიზმები (იხ. სურ. S2). ამ პრობლემის თავიდან აცილება შესაძლებელია ჟანგბადის (ან ნებისმიერი სხვა სასიცოცხლო მნიშვნელობის მქონე გაზისთვის) გამტარი სუბსტრატის გამოყენებით, გადასაფარებლის შიგნით ჩარჩენილი ჰაერის ბუშტების დატოვებით, ან ზედა საფარზე ხვრელების გაბურღვით (იხ. ნახ. S1) 45 . ამ კვლევაში ჩვენ ავირჩიეთ უკანასკნელი გამოსავალი (სურათები 1b და S1). და ბოლოს, ლაზერული გათბობა არ იძლევა ტემპერატურის ერთგვაროვან განაწილებას. ლაზერის სხივის იმავე ინტენსივობის დროსაც კი (ნახ. 1დ), ტემპერატურის განაწილება არ არის ერთგვაროვანი, არამედ წააგავს გაუსის განაწილებას თერმული დიფუზიის გამო (ნახ. 1e). როდესაც მიზანია ბიოლოგიური სისტემების შესასწავლად მხედველობის არეში ზუსტი ტემპერატურის დადგენა, არათანაბარი პროფილები იდეალური არ არის და ასევე შეიძლება გამოიწვიოს ბაქტერიების თერმოფორეზული მოძრაობა, თუ ისინი არ ეკვრის სუბსტრატს (იხ. სურ. S3, S4)39. ამ მიზნით, ჩვენ გამოვიყენეთ სივრცითი სინათლის მოდულატორი (SLM) ინფრაწითელი ლაზერის სხივის ფორმის მიხედვით ნიმუშის სიბრტყეში რგოლის ფორმის მიხედვით (ნახ. 1f), რათა მივაღწიოთ ტემპერატურის იდეალურად ერთგვაროვან განაწილებას მოცემულ გეომეტრიულ არეალში. მიუხედავად თერმული დიფუზიისა (ნახ. 1დ) 39, 42, 46. მოათავსეთ ზედა საფარი ლითონის ჭურჭელზე (სურათი 1ბ), რათა თავიდან აიცილოთ საშუალების აორთქლება და დააკვირდეთ მინიმუმ რამდენიმე დღის განმავლობაში. იმის გამო, რომ ეს ზედა საფარი არ არის დალუქული, საჭიროების შემთხვევაში, დამატებითი საშუალების ადვილად დამატება შესაძლებელია ნებისმიერ დროს.
იმის საილუსტრაციოდ, თუ როგორ მუშაობს LA-HTM და ვაჩვენოთ მისი გამოყენებადობა თერმოფილურ კვლევებში, ჩვენ შევისწავლეთ აერობული ბაქტერია Geobacillus stearothermophilus, რომელსაც აქვს ზრდის ოპტიმალური ტემპერატურა დაახლოებით 60-65°C. ბაქტერიას ასევე აქვს დროშები და ცურვის უნარი, რაც უზრუნველყოფს უჯრედული ნორმალური აქტივობის კიდევ ერთ მაჩვენებელს.
ნიმუშები (ნახ. 1ბ) წინასწარ იყო ინკუბირებული 60°C-ზე ერთი საათის განმავლობაში და შემდეგ მოთავსებული იქნა LA-HTM ნიმუშის დამჭერში. ეს წინასწარი ინკუბაცია არჩევითია, მაგრამ მაინც სასარგებლო, ორი მიზეზის გამო: პირველი, როდესაც ლაზერი ჩართულია, ის იწვევს უჯრედების მყისიერ ზრდას და დაყოფას (იხილეთ ფილმი M1 დამატებითი მასალებიდან). წინასწარი ინკუბაციის გარეშე, ბაქტერიების ზრდა, როგორც წესი, შეფერხებულია დაახლოებით 40 წუთით ყოველ ჯერზე, როდესაც ნიმუშზე ახალი სანახავი არე გაცხელდება. მეორე, 1 საათიანი წინასწარი ინკუბაცია ხელს უწყობდა ბაქტერიების გადაბმას საფართან, რაც ხელს უშლიდა უჯრედების მხედველობის ველის გარეთ გამოსვლას ლაზერის ჩართვისას თერმოფორეზის გამო (იხ. ფილმი M2 დამატებითი მასალებიდან). თერმოფორეზი არის ნაწილაკების ან მოლეკულების მოძრაობა ტემპერატურული გრადიენტის გასწვრივ, ჩვეულებრივ, ცხელიდან ცივამდე და ბაქტერიები არ არის გამონაკლისი43,47. ეს არასასურველი ეფექტი აღმოიფხვრება მოცემულ ტერიტორიაზე SLM-ის გამოყენებით ლაზერის სხივის ფორმირებისთვის და ტემპერატურის ბრტყელი განაწილების მისაღწევად.
ნახ. სურათი 2 გვიჩვენებს ტემპერატურის განაწილებას, რომელიც იზომება CGM-ით, რომელიც მიღებულია ოქროს ნანონაწილაკებით დაფარული შუშის სუბსტრატის რგოლოვანი ლაზერის სხივით დასხივებით (ნახ. 1f). დაფიქსირდა ტემპერატურის ბრტყელი განაწილება ლაზერის სხივით დაფარულ მთელ ტერიტორიაზე. ეს ზონა დაყენებული იყო 65°C-ზე, ზრდის ოპტიმალურ ტემპერატურაზე. ამ რეგიონის გარეთ, ტემპერატურის მრუდი ბუნებრივად ეცემა \(1/r\)-მდე (სადაც \(r\) არის რადიალური კოორდინატი).
CGM გაზომვების ტემპერატურული რუკა, რომელიც მიღებულია რგოლოვანი ლაზერის სხივის გამოყენებით ოქროს ნანონაწილაკების ფენის დასხივების მიზნით, რათა მივიღოთ ბრტყელი ტემპერატურის პროფილი წრიულ არეალზე. ბ ტემპერატურის რუკის იზოთერმი (a). ლაზერის სხივის კონტური წარმოდგენილია ნაცრისფერი წერტილოვანი წრით. ექსპერიმენტი ორჯერ განმეორდა (იხ. დამატებითი მასალები, სურათი S4).
ბაქტერიული უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა მონიტორინგდა რამდენიმე საათის განმავლობაში LA-HTM-ის გამოყენებით. ნახ. 3 აჩვენებს დროის ინტერვალს ოთხი სურათისთვის, რომელიც გადაღებულია 3 საათიანი 20 წუთიანი ფილმიდან (ფილმი M3, დამატებითი ინფორმაცია). დაფიქსირდა, რომ ბაქტერიები აქტიურად მრავლდებიან ლაზერით განსაზღვრულ წრიულ ზონაში, სადაც ტემპერატურა ოპტიმალური იყო, უახლოვდებოდა 65°C-ს. ამის საპირისპიროდ, უჯრედების ზრდა მნიშვნელოვნად შემცირდა, როდესაც ტემპერატურა 10 წამის განმავლობაში 50°C-ზე დაბლა დაეცა.
G. stearothermophilus ბაქტერიების ოპტიკური სიღრმის სურათები, რომლებიც იზრდება ლაზერული გათბობის შემდეგ სხვადასხვა დროს, (a) t = 0 წთ, (ბ) 1 სთ 10 წთ, (გ) 2 სთ 20 წთ, (დ) 3 სთ 20 წთ, გარეთ 200 ამოღებულია ერთწუთიანი ფილმიდან (M3 ფილმი მოწოდებულია დამატებით ინფორმაციაში) შესაბამისი ტემპერატურის რუკაზე გადატანილი. ლაზერი ირთვება \(t=0\) დროს. ინტენსივობის გამოსახულებას დაემატა იზოთერმები.
უჯრედის ზრდისა და ტემპერატურაზე მისი დამოკიდებულების შემდგომი რაოდენობრივი დასადგენად, ჩვენ გავზომეთ ბიომასის ზრდა თავდაპირველად იზოლირებული ბაქტერიების სხვადასხვა კოლონიებში Movie M3 ხედვის ველში (ნახ. 4). მინი კოლონიის ფორმირების ერთეულის (mCFU) ფორმირების დასაწყისში შერჩეული მშობელი ბაქტერიები ნაჩვენებია სურათზე S6. მშრალი მასის გაზომვები ჩატარდა CGM 48 კამერით, რომელიც გამოიყენებოდა ტემპერატურის განაწილების შესამოწმებლად. CGM-ის უნარი გაზომოს მშრალი წონა და ტემპერატურა არის LA-HTM სიძლიერე. როგორც მოსალოდნელი იყო, მაღალმა ტემპერატურამ გამოიწვია ბაქტერიების უფრო სწრაფი ზრდა (ნახ. 4a). როგორც ნაჩვენებია ნახევრად ლოგზე ნახაზზე 4b, ზრდა ყველა ტემპერატურაზე მოჰყვება ექსპონენციალურ ზრდას, სადაც მონაცემები იყენებს ექსპონენციალურ ფუნქციას \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), სადაც \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – გენერირების დრო (ან გაორმაგების დრო), \( g =1/ \tau\) – ზრდის ტემპი (განყოფილებების რაოდენობა დროის ერთეულზე). ნახ. 4c გვიჩვენებს ზრდის შესაბამის ტემპს და წარმოქმნის დროს ტემპერატურის ფუნქციის მიხედვით. სწრაფად მზარდი mCFU ხასიათდება ზრდის გაჯერებით ორი საათის შემდეგ, მოსალოდნელი ქცევა ბაქტერიების მაღალი სიმკვრივის გამო (მსგავსი სტაციონარული ფაზა კლასიკურ თხევად კულტურებში). ზოგადი ფორმა \(g\left(T\right)\) (ნახ. 4c) შეესაბამება G. stearothermophilus-ის მოსალოდნელ ორფაზიან მრუდს ოპტიმალური ზრდის ტემპით დაახლოებით 60-65°C. შეადარეთ მონაცემები კარდინალური მოდელის გამოყენებით (სურათი S5)49 სადაც \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\მარჯვნივ)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, რაც კარგად ემთხვევა ლიტერატურაში მოყვანილ სხვა მნიშვნელობებს49. მიუხედავად იმისა, რომ ტემპერატურაზე დამოკიდებული პარამეტრები განმეორებადია, \({G}_{0}\)-ის მაქსიმალური ზრდის ტემპი შეიძლება განსხვავდებოდეს ერთი ექსპერიმენტიდან მეორეზე (იხ. ნახატები S7-S9 და ფილმი M4). ტემპერატურის მორგების პარამეტრებისგან განსხვავებით, რომლებიც უნივერსალური უნდა იყოს, ზრდის მაქსიმალური ტემპი დამოკიდებულია გარემოს თვისებებზე (კვებითი ელემენტების ხელმისაწვდომობა, ჟანგბადის კონცენტრაცია) დაკვირვებულ მიკრომასშტაბიან გეომეტრიაში.
მიკრობული ზრდა სხვადასხვა ტემპერატურაზე. mCFU: მინიატურული კოლონიის ფორმირების ერთეულები. ტემპერატურულ გრადიენტში მზარდი ერთი ბაქტერიის ვიდეოდან მიღებული მონაცემები (ფილმი M3). b იგივეა, რაც (a), ნახევრად ლოგარითმული მასშტაბი. c ზრდის ტემპი\(\tau\) და წარმოქმნის დრო\(g\) გამოითვლება წრფივი რეგრესიიდან (b). ჰორიზონტალური შეცდომის ზოლები: ტემპერატურის დიაპაზონი, რომლის დროსაც mCFUs გაფართოვდა ხედვის ველში ზრდის დროს. შეცდომის ვერტიკალური ზოლები: ხაზოვანი რეგრესიის სტანდარტული შეცდომა.
ნორმალური ზრდის გარდა, ზოგიერთი ბაქტერია ზოგჯერ ლაზერული გაცხელების დროს ჩანდა, რაც მოსალოდნელია ფლაგელას მქონე ბაქტერიებისთვის. ფილმი M5 დამატებით ინფორმაციაში გვიჩვენებს საცურაო აქტივობებს. ამ ექსპერიმენტში გამოყენებული იქნა ერთიანი ლაზერული გამოსხივება ტემპერატურის გრადიენტის შესაქმნელად, როგორც ეს ნაჩვენებია სურათებში 1d, e და S3. სურათი 5 გვიჩვენებს M5 ფილმიდან შერჩეულ გამოსახულების ორ თანმიმდევრობას, რომლებიც აჩვენებს, რომ ერთი ბაქტერია ავლენს მიმართულ მოძრაობას, ხოლო ყველა სხვა ბაქტერია უმოძრაო რჩება.
ორი დროის ჩარჩო (a) და (b) აჩვენებს ორი განსხვავებული ბაქტერიის ცურვას, რომლებიც მონიშნულია წერტილოვანი წრეებით. სურათები ამოღებულია M5 ფილმიდან (მოწოდებულია როგორც დამატებითი მასალა).
G. stearothermophilus-ის შემთხვევაში, ბაქტერიების აქტიური მოძრაობა (ნახ. 5) დაიწყო ლაზერის სხივის ჩართვის შემდეგ რამდენიმე წამში. ეს დაკვირვება ხაზს უსვამს ამ თერმოფილური მიკროორგანიზმის დროებით რეაქციას ტემპერატურის მატებაზე, როგორც უკვე შენიშნა მორამ და სხვებმა. 24 . ბაქტერიების მოძრაობისა და თუნდაც თერმოტაქსის თემის შემდგომი შესწავლა შესაძლებელია LA-HTM-ის გამოყენებით.
მიკრობული ცურვა არ უნდა აგვერიოს სხვა სახის ფიზიკურ მოძრაობასთან, კერძოდ (i) ბრაუნის მოძრაობასთან, რომელიც, როგორც ჩანს, არის ქაოტური მოძრაობა განსაზღვრული მიმართულების გარეშე, (ii) კონვექცია 50 და თერმოფორეზი 43, რომელიც შედგება მოძრაობის რეგულარულ მოძრაობაში ტემპერატურის გასწვრივ. გრადიენტი.
G. stearothermophilus ცნობილია თავისი უნარით წარმოქმნას მაღალი რეზისტენტული სპორები (სპორების წარმოქმნა), როდესაც ექვემდებარება არახელსაყრელ გარემო პირობებს, როგორც დაცვას. როდესაც გარემო პირობები ხელახლა გახდება ხელსაყრელი, სპორები აღმოცენდებიან, წარმოქმნიან ცოცხალ უჯრედებს და აღადგენენ ზრდას. მიუხედავად იმისა, რომ ეს სპორულაციის/გამწვანების პროცესი კარგად არის ცნობილი, ის არასოდეს ყოფილა დაფიქსირებული რეალურ დროში. LA-HTM-ის გამოყენებით, ჩვენ აქ ვახსენებთ G. stearothermophilus-ში გამწვანების მოვლენებზე პირველ დაკვირვებას.
ნახ. 6a გვიჩვენებს ოპტიკური სიღრმის (OT) გამოსახულებებს, რომლებიც მიიღება 13 სპორის CGM ნაკრების გამოყენებით. შეგროვების მთელი დროის განმავლობაში (15 სთ 6 წთ, \(t=0\) – ლაზერული გაცხელების დასაწყისი), 13 სპორიდან 4 აღმოცენდა, თანმიმდევრული დროის წერტილებში \(t=2\) სთ, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' და \(11\) h \(30\)'. მიუხედავად იმისა, რომ ამ მოვლენათაგან მხოლოდ ერთია ნაჩვენები სურათზე 6, M6 ფილმში შეიძლება დაფიქსირდეს 4 აღმოცენების მოვლენა დამატებით მასალაში. საინტერესოა, რომ აღმოცენება შემთხვევითი ჩანს: ყველა სპორა არ აღმოცენდება და არ აღმოცენდება ერთდროულად, მიუხედავად გარემო პირობების იგივე ცვლილებისა.
Time-lapse, რომელიც შედგება 8 OT გამოსახულებისგან (ზეთის ჩაძირვა, 60x, 1.25 NA ობიექტივი) და (ბ) G. stearothermophilus აგრეგატების ბიომასის ევოლუცია. გ (ბ) დახატულია ნახევრად ლოგის სკალაზე ზრდის ტემპის წრფივობის ხაზგასასმელად (გამოწყვეტილი ხაზი).
ნახ. 6b,c გვიჩვენებს უჯრედების პოპულაციების ბიომასას მხედველობის ველში დროის ფუნქციად მონაცემთა შეგროვების მთელი პერიოდის განმავლობაში. მშრალი მასის სწრაფი დაშლა დაფიქსირდა \(t=5\)სთ-ზე ნახ. 6b, c, ზოგიერთი უჯრედის ხედვის ველიდან გამოსვლის გამო. ამ ოთხი მოვლენის ზრდის ტემპი არის \(0.77\pm 0.1\) h-1. ეს მნიშვნელობა უფრო მაღალია, ვიდრე ზრდის ტემპი, რომელიც ასოცირდება სურათზე 3. 3 და 4, სადაც უჯრედები ნორმალურად იზრდება. სპორებიდან G. stearothermophilus-ის ზრდის ტემპის გაზრდის მიზეზი გაურკვეველია, მაგრამ ეს გაზომვები ხაზს უსვამს LA-HTM-ის ინტერესს და მუშაობს ერთ უჯრედულ დონეზე (ან ერთი mCFU დონეზე), რათა გაიგოთ მეტი უჯრედის სიცოცხლის დინამიკის შესახებ. .
LA-HTM-ის მრავალფეროვნებისა და მისი მუშაობის მაღალ ტემპერატურაზე შემდგომი დემონსტრირებისთვის, ჩვენ გამოვიკვლიეთ Sulfolobus shibatae-ის ზრდა, ჰიპერთერმოფილური აციდოფილური არქეა, რომლის ზრდის ოპტიმალური ტემპერატურაა 80°C51. G. stearothermophilus-თან შედარებით, ამ არქეებს ასევე აქვთ ძალიან განსხვავებული მორფოლოგია, უფრო წაგრძელებულ ღეროებს (ბაცილებს) წააგავს 1 მიკრონის სფეროებს (კოკები).
სურათი 7a შედგება S. shibatae mCFU-ის თანმიმდევრული ოპტიკური სიღრმის გამოსახულებებისაგან, მიღებული CGM-ის გამოყენებით (იხ. M7 მხატვრული ფილმი დამატებით მასალებში). ეს mCFU იზრდება დაახლოებით 73°C ტემპერატურაზე, 80°C ოპტიმალური ტემპერატურის ქვემოთ, მაგრამ აქტიური ზრდის ტემპერატურულ დიაპაზონში. ჩვენ დავაკვირდით მრავალჯერადი დაშლის მოვლენას, რამაც mCFU-ები რამდენიმე საათის შემდეგ არქეის მიკროყურძნის მსგავსი გახადა. ამ OT სურათებიდან, mCFU ბიომასის გაზომვა მოხდა დროთა განმავლობაში და წარმოდგენილი იყო სურათზე 7b. საინტერესოა, რომ S. shibatae mCFU-ებმა აჩვენეს წრფივი ზრდა და არა ექსპონენციალური ზრდა, რომელიც ჩანს G. stearothermophilus mCFU-ებით. დიდი ხნის განმავლობაში მიმდინარეობდა დისკუსია 52 უჯრედების ზრდის ტემპების ბუნების შესახებ: მაშინ, როცა ზოგიერთი კვლევა აფიქსირებს მიკრობების ზრდის ტემპებს, რომლებიც მათი ზომის პროპორციულია (ექსპონენციალური ზრდა), სხვები აჩვენებს მუდმივ ტემპს (წრფივი ან ორხაზოვანი ზრდა). როგორც Tzur et al.53 განმარტავენ, ექსპონენციალური და (ბი)წრფივი ზრდის განსხვავება მოითხოვს <6% სიზუსტეს ბიომასის გაზომვებში, რაც მიუწვდომელია QPM ტექნიკის უმეტესობისთვის, ინტერფერომეტრიის ჩათვლითაც კი. როგორც Tzur et al.53 განმარტავენ, ექსპონენციალური და (ბი)წრფივი ზრდის განსხვავება მოითხოვს <6% სიზუსტეს ბიომასის გაზომვებში, რაც მიუწვდომელია QPM ტექნიკის უმეტესობისთვის, ინტერფერომეტრიის ჩათვლითაც კი. როგორ შეცვალა ფერი და др.53, განსხვავებულობა экспоненциального и (би)линейного роста ნიშნავდა სიზუსტეს <6% გაზომვებით ბიომასსში, რაც არ არის საკმარისი QPM მეთოდის სიძლიერისთვის, რომელიც გამოიყენება ინტერფერომეტრიის გამოყენებით. როგორც Zur et al.53 განმარტავენ, ექსპონენციალური და (ბი)წრფივი ზრდის განსხვავება მოითხოვს <6% სიზუსტეს ბიომასის გაზომვებში, რაც მიუწვდომელია QPM მეთოდების უმეტესობისთვის, თუნდაც ინტერფერომეტრიის გამოყენებით.როგორც განმარტავენ ზურმა და სხვებმა. 53, ექსპონენციური და (ბი) წრფივი ზრდის განსხვავება მოითხოვს ბიომასის გაზომვების 6%-ზე ნაკლებ სიზუსტეს, რაც მიუწვდომელია QPM მეთოდების უმეტესობისთვის, მაშინაც კი, როდესაც გამოიყენება ინტერფერომეტრია. CGM ამ სიზუსტეს აღწევს ქვეპგ სიზუსტით ბიომასის გაზომვებში36,48.
Time-lapse, რომელიც შედგება 6 OT გამოსახულებისგან (ზეთში ჩაძირვა, 60x, NA ობიექტივი 1.25) და (ბ) მიკრო-CFU ბიომასის ევოლუცია გაზომილი CGM-ით. დამატებითი ინფორმაციისთვის იხილეთ ფილმი M7.
S. shibatae-ის სრულყოფილად ხაზოვანი ზრდა მოულოდნელი იყო და ჯერ არ არის მოხსენებული. თუმცა, მოსალოდნელია ექსპონენციალური ზრდა, თუნდაც იმიტომ, რომ დროთა განმავლობაში უნდა მოხდეს 2, 4, 8, 16 ... უჯრედების მრავალჯერადი გაყოფა. ჩვენ ვივარაუდეთ, რომ წრფივი ზრდა შეიძლება გამოწვეული იყოს უჯრედების მკვრივი შეფუთვის გამო უჯრედების დათრგუნვით, ისევე როგორც უჯრედების ზრდა შენელდება და საბოლოოდ აღწევს მიძინებულ მდგომარეობას, როდესაც უჯრედის სიმკვრივე ძალიან მაღალია.
ჩვენ დავასკვნათ შემდეგი ხუთი საინტერესო წერტილის განხილვით: გათბობის მოცულობის შემცირება, თერმული ინერციის შემცირება, ინტერესი ოქროს ნანონაწილაკებით, ინტერესი რაოდენობრივი ფაზის მიკროსკოპით და შესაძლო ტემპერატურის დიაპაზონი, რომელშიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას LA-HTM.
რეზისტენტულ გათბობასთან შედარებით, ლაზერული გათბობა, რომელიც გამოიყენება HTM-ის განვითარებისთვის, გვთავაზობს რამდენიმე უპირატესობას, რასაც ჩვენ ვაჩვენებთ ამ კვლევაში. კერძოდ, თხევად მედიაში მიკროსკოპის ხედვის ველში, გათბობის მოცულობა ინახება რამდენიმე (10 μm) 3 მოცულობის ფარგლებში. ამგვარად, მხოლოდ დაკვირვებული მიკრობები არიან აქტიური, ხოლო სხვა ბაქტერიები მიძინებულები არიან და მათი გამოყენება შესაძლებელია ნიმუშის შემდგომი შესწავლისთვის - არ არის საჭირო ნიმუშის შეცვლა ყოველ ჯერზე, როცა საჭიროა ახალი ტემპერატურის შემოწმება. გარდა ამისა, მიკრომასშტაბიანი გათბობა იძლევა ტემპერატურის დიდი დიაპაზონის პირდაპირი შემოწმების საშუალებას: სურათი 4c მიღებულია 3-საათიანი ფილმიდან (ფილმი M3), რომელიც ჩვეულებრივ მოითხოვს რამდენიმე ნიმუშის მომზადებას და გამოკვლევას - თითო შესწავლილი ნიმუშისთვის. y არის ტემპერატურა, რომელიც წარმოადგენს ექსპერიმენტის დღეების რაოდენობას. გაცხელებული მოცულობის შემცირება ასევე ინარჩუნებს მიკროსკოპის ყველა მიმდებარე ოპტიკურ კომპონენტს, განსაკუთრებით ობიექტურ ლინზას, ოთახის ტემპერატურაზე, რაც აქამდე საზოგადოების მთავარი პრობლემა იყო. LA-HTM შეიძლება გამოყენებულ იქნას ნებისმიერ ლინზთან, მათ შორის ზეთის ჩაძირვის ლინზებთან, და დარჩება ოთახის ტემპერატურაზე, თუნდაც უკიდურესი ტემპერატურის პირობებში ხედვის ველში. ლაზერული გათბობის მეთოდის მთავარი შეზღუდვა, რომელსაც ჩვენ ვახსენებთ ამ კვლევაში, არის ის, რომ უჯრედები, რომლებიც არ იკვრება ან არ ცურავს, შეიძლება იყოს შორს ხედვის ველიდან და რთული შესასწავლი. გამოსავალი შეიძლება იყოს დაბალი გამადიდებელი ლინზების გამოყენება რამდენიმე ასეულ მიკრონზე მეტი ტემპერატურის უფრო დიდი ზრდის მისაღწევად. ამ სიფრთხილეს თან ახლავს სივრცითი გარჩევადობის შემცირება, მაგრამ თუ მიზანია მიკროორგანიზმების მოძრაობის შესწავლა, მაღალი სივრცითი გარჩევადობა არ არის საჭირო.
\({{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) სისტემის გათბობის (და გაგრილების) დროის მასშტაბები დამოკიდებულია მის ზომაზე, კანონის მიხედვით \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), სადაც \ (L\) არის სითბოს წყაროს დამახასიათებელი ზომა (ლაზერის სხივის დიამეტრი ჩვენს კვლევაში არის \(L\ დაახლოებით 100\) μm), \(D\) არის გარემოს თერმული დიფუზიურობა (საშუალო ჩვენს შემთხვევის, მინის და წყლის დიფუზიის სიჩქარე\(D\დაახლოებით 2\ჯერ {10}^{-7}\) მ2/წმ, შესაბამისად, ამ კვლევაში 50 ms-ის რიგის დროის პასუხები, ანუ კვაზიმყისიერი). ტემპერატურის მატების ეს მყისიერი დადგენა არა მხოლოდ ამცირებს ექსპერიმენტის ხანგრძლივობას, არამედ საშუალებას იძლევა ზუსტი დრო \(t=0\) ტემპერატურის ეფექტების ნებისმიერი დინამიური შესწავლისთვის.
ჩვენი შემოთავაზებული მეთოდი გამოიყენება სინათლის შთანთქმის ნებისმიერ სუბსტრატზე (მაგალითად, კომერციული ნიმუშები ITO საფარით). თუმცა, ოქროს ნანონაწილაკებს შეუძლიათ უზრუნველყონ მაღალი შთანთქმა ინფრაწითელში და დაბალი შთანთქმა ხილულ დიაპაზონში, რომელთა ეს უკანასკნელი მახასიათებლები საინტერესოა ეფექტური ოპტიკური დაკვირვებისთვის ხილულ დიაპაზონში, განსაკუთრებით ფლუორესცენციის გამოყენებისას. გარდა ამისა, ოქრო ბიოთავსებადია, ქიმიურად ინერტული, ოპტიკური სიმკვრივის რეგულირება შესაძლებელია 530 ნმ-დან ინფრაწითელთან ახლოს, ხოლო ნიმუშის მომზადება მარტივი და ეკონომიურია29.
განივი ბადე ტალღის ფრონტის მიკროსკოპია (CGM) საშუალებას იძლევა არა მხოლოდ ტემპერატურის რუქების მიკროსკალაზე, არამედ ბიომასის მონიტორინგსაც, რაც მას განსაკუთრებით სასარგებლოს ხდის (თუ არ არის საჭირო) LA-HTM-თან ერთად. გასული ათწლეულის განმავლობაში შემუშავდა ტემპერატურული მიკროსკოპის სხვა ტექნიკა, განსაკუთრებით ბიოვიზუალიზაციის სფეროში და მათი უმეტესობა მოითხოვს ტემპერატურისადმი მგრძნობიარე ფლუორესცენტური ზონდების გამოყენებას54,55. თუმცა, ეს მეთოდები გააკრიტიკეს და ზოგიერთმა მოხსენებამ გაზომა არარეალური ტემპერატურის ცვლილებები უჯრედებში, შესაძლოა იმის გამო, რომ ფლუორესცენცია დამოკიდებულია ბევრ ფაქტორზე, გარდა ტემპერატურისა. გარდა ამისა, ფლუორესცენტური ზონდების უმეტესობა არასტაბილურია მაღალ ტემპერატურაზე. ამიტომ, QPM და განსაკუთრებით CGM წარმოადგენს იდეალურ ტემპერატურულ მიკროსკოპის ტექნიკას მაღალ ტემპერატურაზე სიცოცხლის შესასწავლად ოპტიკური მიკროსკოპის გამოყენებით.
S. shibatae-ის კვლევებმა, რომლებიც ოპტიმალურად ცხოვრობენ 80°C-ზე, აჩვენა, რომ LA-HTM შეიძლება გამოყენებულ იქნას ჰიპერთერმოფილების შესასწავლად და არა მხოლოდ მარტივი თერმოფილების. პრინციპში, არ არსებობს შეზღუდვა ტემპერატურის დიაპაზონში, რომლის მიღწევაც შესაძლებელია LA-HTM-ის გამოყენებით, და 100°C-ზე მაღალი ტემპერატურაც კი შეიძლება მიღწეული იყოს ატმოსფერული წნევის დროს დუღილის გარეშე, როგორც ეს აჩვენა ჩვენი ჯგუფის 38-ისგან ჰიდროთერმული ქიმიის გამოყენებაში ატმოსფეროში. წნევა A. ლაზერი გამოიყენება ოქროს ნანონაწილაკების 40 გასათბობად იმავე გზით. ამრიგად, LA-HTM-ს აქვს პოტენციალი, გამოიყენოს უპრეცედენტო ჰიპერთერმოფილების დასაკვირვებლად სტანდარტული მაღალი გარჩევადობის ოპტიკური მიკროსკოპით სტანდარტულ პირობებში (ანუ გარემოს სტრესის პირობებში).
ყველა ექსპერიმენტი ჩატარდა ხელნაკეთი მიკროსკოპის გამოყენებით, მათ შორის Köhler illumination (LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), ნიმუშის დამჭერი ხელით xy მოძრაობით, მიზნები (Olympus, 60x, 0.7 NA, ჰაერი, LUCPlanFLN60X ან 60x, ONA1. , UPLFLN60XOI), CGM კამერა (QLSI ჯვარედინი ბადე, 39 μm მოედანი, 0,87 მმ Andor Zyla კამერის სენსორიდან) ინტენსივობის და ტალღის ფრონტის გამოსახულების უზრუნველსაყოფად და sCMOS კამერა (ORCA Flash 4.0 V3, 16-ბიტიანი რეჟიმი, Hamamatsu-დან) ჩაწერისთვის. მონაცემები ნაჩვენებია სურათზე 5 (ბაქტერიული ცურვა). დიქროული სხივის გამყოფი არის 749 ნმ BrightLine კიდე (Semrock, FF749-SDi01). კამერის წინა ფილტრი არის 694 მოკლე უღელტეხილის ფილტრი (FF02-694/SP-25, Semrock). ტიტანის საფირონის ლაზერი (Laser Verdi G10, 532 ნმ, 10 W, ტუმბოს ცუნამის ლაზერის ღრუ, Spectra-Physics ნახ. 2-5, შემდგომში ჩანაცვლებული Millenia ლაზერით, Spectraphysics 10 W, pumped Mira laser cavity, Coherent2, for. -5). 6 და 7) დაყენებულია ტალღის სიგრძეზე \({{{({\rm{\lambda }}}}}=800\) ნმ, რომელიც შეესაბამება ოქროს ნანონაწილაკების პლაზმონის რეზონანსულ სპექტრს.სივრცული სინათლის მოდულატორები (1920 × 1152 პიქსელი) შეძენილია Meadowlark Optics-ისგან.
ჯვარედინი ბადე ტალღის ფრონტის მიკროსკოპია (CGM) არის ოპტიკური მიკროსკოპის ტექნიკა, რომელიც დაფუძნებულია ორგანზომილებიანი დიფრაქციული ბადეების გაერთიანებაზე (ასევე ცნობილია როგორც ჯვარედინი ბადე) ჩვეულებრივი კამერის სენსორიდან ერთი მილიმეტრის მანძილზე. CGM-ის ყველაზე გავრცელებულ მაგალითს, რომელიც ჩვენ გამოვიყენეთ ამ კვლევაში, ეწოდება ოთხი ტალღის სიგრძის განივი ცვლის ინტერფერომეტრს (QLSI), სადაც ჯვარედინი ბადე შედგება ინტენსივობის/ფაზის ჩექმის შაბლონისგან, რომელიც შემოღებული და დაპატენტებულია Primot et al. 200034. ვერტიკალური და ჰორიზონტალური ბადეების ხაზები ქმნიან ქსელის მსგავს ჩრდილებს სენსორზე, რომელთა დამახინჯება შეიძლება რიცხობრივად დამუშავდეს რეალურ დროში, რათა მივიღოთ ტალღის ფრონტის ოპტიკური დამახინჯება (ან ექვივალენტური ფაზის პროფილი) ინციდენტური სინათლის. მიკროსკოპზე გამოყენებისას, CGM კამერას შეუძლია აჩვენოს გამოსახულებადი ობიექტის ოპტიკური ბილიკის სხვაობა, რომელიც ასევე ცნობილია როგორც ოპტიკური სიღრმე (OT), მგრძნობელობით ნანომეტრების რიგითობით36. ნებისმიერი CGM გაზომვისას, ოპტიკურ კომპონენტებში ან სხივებში რაიმე დეფექტის აღმოსაფხვრელად, პირველადი საცნობარო OT გამოსახულება უნდა იქნას აღებული და გამოკლებული ნებისმიერი შემდგომი სურათისგან.
ტემპერატურული მიკროსკოპია ჩატარდა CGM კამერის გამოყენებით, როგორც ეს აღწერილია მითითებაში. 32. მოკლედ, სითხის გაცხელება ცვლის მის რეფრაქციულ ინდექსს, ქმნის თერმული ლინზის ეფექტს, რომელიც ამახინჯებს დაცემის სხივს. ტალღის ფრონტის ეს დამახინჯება იზომება CGM-ით და მუშავდება დეკონვოლუციის ალგორითმის გამოყენებით თხევად გარემოში ტემპერატურის სამგანზომილებიანი განაწილების მისაღებად. თუ ოქროს ნანონაწილაკები თანაბრად ნაწილდება მთელ ნიმუშზე, ტემპერატურის რუქა შეიძლება გაკეთდეს ბაქტერიებისგან თავისუფალ ადგილებში უკეთესი სურათების მისაღებად, რასაც ჩვენ ზოგჯერ ვაკეთებთ. საცნობარო CGM გამოსახულება შეძენილი იქნა გათბობის გარეშე (ლაზერის გამორთვით) და შემდგომში გადაღებული იქნა გამოსახულების იმავე ადგილას ლაზერით ჩართული.
მშრალი მასის გაზომვა მიიღწევა იმავე CGM კამერის გამოყენებით, რომელიც გამოიყენება ტემპერატურის გამოსახულების მისაღებად. CGM საცნობარო გამოსახულებები მიღებულ იქნა ნიმუშის სწრაფი გადაადგილებით x და y ექსპოზიციის დროს, როგორც საშუალება OT-ში ნებისმიერი არაჰომოგენურობის საშუალოდ ბაქტერიების არსებობის გამო. ბაქტერიების OT გამოსახულებებიდან, მათი ბიომასა მიღებული იქნა სურათების ანსამბლის გამოყენებით Matlab-ის ხელნაკეთი სეგმენტაციის ალგორითმის გამოყენებით შერჩეულ უბნებზე (იხ. ქვეგანყოფილება „რიცხობრივი კოდი“), აღწერილი პროცედურის შემდეგ. 48. მოკლედ, ვიყენებთ მიმართებას \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), სადაც \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) არის ოპტიკური სიღრმის სურათი, \(m\) არის მშრალი წონა და \({{{{\rm{\alpha }}}}}}\) არის მუდმივი. ჩვენ ავირჩიეთ \({{{\rm{\alpha))))))=0.18\) μm3/pg, რომელიც ტიპიური მუდმივია ცოცხალი უჯრედებისთვის.
25 მმ დიამეტრის და 150 მკმ სისქის ოქროს ნანონაწილაკებით დაფარული საფარი მოთავსდა AttofluorTM კამერაში (თერმოფიშერი) ოქროს ნანონაწილაკებით ზემოთ. Geobacillus stearothermophilus წინასწარ კულტივირებული იყო ღამით LB გარემოში (200 rpm, 60°C) ექსპერიმენტების ყოველი დღის წინ. G. stearothermophilus-ის სუსპენზიის 5 მკლ წვეთი ოპტიკური სიმკვრივით (OD) 0.3-დან 0.5-მდე მოთავსებული იყო საფარზე ოქროს ნანონაწილაკებით. შემდეგ, წვეთზე ჩამოაგდეს მრგვალი საფარი 18 მმ დიამეტრის 5 მმ დიამეტრის ნახვრეტით ცენტრში და 5 მკლ ბაქტერიული სუსპენზია იგივე ოპტიკური სიმკვრივით განმეორებით იქნა გამოყენებული ხვრელის ცენტრში. გადასაფარებლებზე არსებული ჭები მომზადებული იყო წინამდებარე პუნქტში აღწერილი პროცედურის შესაბამისად. 45 (დამატებითი ინფორმაციისთვის იხილეთ დამატებითი ინფორმაცია). შემდეგ დაამატეთ 1 მლ LB საშუალო საფარს, რათა თავიდან აიცილოთ თხევადი ფენის გამოშრობა. ბოლო საფარი მოთავსებულია Attofluor™ კამერის დახურულ სახურავზე, რათა თავიდან აიცილოს საშუალების აორთქლება ინკუბაციის დროს. აღმოცენების ექსპერიმენტებისთვის გამოვიყენეთ სპორები, რომლებიც ჩვეულებრივი ექსპერიმენტების შემდეგ ზოგჯერ ზედა საფარს ფარავდა. მსგავსი მეთოდით იქნა მიღებული Sulfolobus shibatae. სამი დღე (200 rpm, 75°C) Thiobacillus serrata-ს წინასწარი კულტივაცია ჩატარდა საშუალო 182-ში (DSMZ).
ოქროს ნანონაწილაკების ნიმუშები მომზადდა მიცელარული ბლოკის კოპოლიმერული ლითოგრაფიით. ეს პროცესი დეტალურად არის აღწერილი თავში. 60. მოკლედ, მიცელი, რომელიც შეიცავს ოქროს იონებს, სინთეზირებული იყო კოპოლიმერის HAuCl4-თან ტოლუენში შერევით. შემდეგ გაწმენდილი საფარები ჩაეფლო ხსნარში და დამუშავდა ულტრაიისფერი დასხივებით შემცირების აგენტის თანდასწრებით ოქროს თესლის მისაღებად. და ბოლოს, ოქროს თესლი გაიზარდა 16 წუთის განმავლობაში KAuCl4-ისა და ეთანოლამინის წყალხსნართან შეხების გზით, რამაც გამოიწვია არასფერული ოქროს ნანონაწილაკების კვაზი-პერიოდული და ძალიან ერთგვაროვანი განლაგება ახლო ინფრაწითელში.
ინტერფეროგრამების OT სურათებად გადასაყვანად, ჩვენ გამოვიყენეთ ხელნაკეთი ალგორითმი, როგორც ეს დეტალურადაა მოცემული ბმულზე. 33 და ხელმისაწვდომია როგორც Matlab პაკეტი შემდეგ საჯარო საცავში: https://github.com/baffou/CGMprocess. პაკეტს შეუძლია გამოთვალოს ინტენსივობა და OT სურათები ჩაწერილი ინტერფეროგრამების (მათ შორის საცნობარო სურათების) და კამერის მასივის დისტანციებზე დაყრდნობით.
SLM-ზე გამოყენებული ფაზის ნიმუშის გამოსათვლელად მოცემული ტემპერატურის პროფილის მისაღებად, ჩვენ გამოვიყენეთ ადრე შემუშავებული ხელნაკეთი ალგორითმი39,42, რომელიც ხელმისაწვდომია შემდეგ საჯარო საცავში: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. შეყვანა არის სასურველი ტემპერატურის ველი, რომლის დაყენება შესაძლებელია ციფრულად ან მონოქრომული bmp გამოსახულების საშუალებით.
უჯრედების სეგმენტაციისთვის და მათი მშრალი წონის გასაზომად, ჩვენ გამოვიყენეთ ჩვენი Matlab ალგორითმი, რომელიც გამოქვეყნებულია შემდეგ საჯარო საცავში: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. თითოეულ სურათზე მომხმარებელმა უნდა დააჭიროს საინტერესო ბაქტერიას ან mCFU-ს, შეცვალოს კვერთხის მგრძნობელობა და დაადასტუროს არჩევანი.
კვლევის დიზაინის შესახებ დამატებითი ინფორმაციისთვის იხილეთ ბუნების კვლევის ანგარიშის აბსტრაქტი, რომელიც დაკავშირებულია ამ სტატიასთან.
ამ კვლევის შედეგების დამადასტურებელი მონაცემები ხელმისაწვდომია შესაბამისი ავტორებისგან გონივრული მოთხოვნით.
ამ კვლევაში გამოყენებული წყაროს კოდი დეტალურად არის აღწერილი მეთოდების განყოფილებაში, ხოლო გამართვის ვერსიები შეგიძლიათ ჩამოტვირთოთ https://github.com/baffou/ შემდეგ საცავებში: SLM_temperatureShaping, CGMprocess და CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight to thermophiles და მათი ფართო სპექტრის აპლიკაციები. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight to thermophiles და მათი ფართო სპექტრის აპლიკაციები.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. and Sharma, AK თერმოფილების მიმოხილვა და მათი ფართო გამოყენება. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. და Sharma AK თერმოფილების ღრმა გაგება და აპლიკაციების ფართო სპექტრი.3 ბიოტექნოლოგია 6, 81 (2016).
გამოქვეყნების დრო: სექ-26-2022